种公牛冻精总RNA的提取方法及不同活力精子piRNA检测和应用

本发明涉及一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测，具体为一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测和应用，属于分子育种技术应用领域。

背景技术：

1、在奶牛繁育中，选择优质种公牛冻精是提高母牛受胎率的关键因素。在种公牛选择指标中添加精液品质性状，可有效提高母牛繁殖效率，增加母牛和公牛的利用率。种公牛的精液品质性状主要包括射精量、鲜精活力、精子密度、冻精活力和精子畸形率等。这些精液指标的优劣能显著影响母牛的受胎率、输精指数、产犊间隔等关键的母牛繁殖指标。因此，提高种公牛精液品质性状是决定奶牛场经济效益的关键因素。

2、不同精液品质的牛精子中表现出不同的精子rna表达谱，随着高通量转录组测序技术的普及，通过分析精子中含有的rna成份差异有望成为一种评价精液品质的新方法。然而精子是一类高度分化的生殖细胞，精子中rna的含量很低，且因精子头部染色体高度浓缩，rna包裹在精子内部不易释放。因此，高质量提取精子rna是进一步探究精子功能的首要突破点。开发精子rna的高效高质量提取方法，有利于准确探索公牛精子功能相关rna的差异，以及对精液品质进行预测和准确评价等具有很大的应用价值。

3、在公牛精子rna中，pirna首次在果蝇睾丸组织中被发现的一类长度在26-33nt的核苷酸单链小rna，在机体中这类srna主要通过抑制基因的表达发挥作用。pirna主要起源于基因组的重复序列区域和转座子区域，与特异性蛋白piwi蛋白结合发挥作用，因此将此类srna称为pirna(piwi-interacting rna)。pirna的差异表达与精子耐冻能力和冻后损伤相关，有助于进一步解析冷冻损伤和低温保护的分子机制。本方案中，通过不同活力的精子rna进行高通量转录组测序，获得了与精液品质相关的pirna，开发基于pirna的评估公牛精子活力的分子芯片，pirna表达差异可作为精液品质性状优劣的潜在分子标记，有助于进一步解析精液品质性状形成的遗传基础。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测和应用。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种种公牛冻精总rna的提取方法，包括以下步骤，

3、s1冻精的复苏和不同活力精子分离纯化

4、1)将种公牛冻精从液氮中取出，迅速置于38℃水浴中20s，迅速复苏，置于预热的1.5ml离心管中；

5、2)分别配置45％和90％的percoll溶液，配置percoll梯度溶液，即用9份percoll原液和1份1.5m的pbs配置100％的percoll溶液，再用0.15m的pbs将上述100％的percoll溶液分别稀释到45％和90％，将复苏后的冻精置于45％的percoll上层，室温1500rpm离心20min；

6、3)离心后，不同活力精子位于不同浓度的percoll溶液中，高活力精子位于90％percoll溶液中，而低活力精子位于45％percoll液层；

7、4)将分离的高低活力精子用预热的1×dpbs(dpbs表示的是杜氏改良pbs)溶液洗涤，清柔洗涤，1500rpm离心15min获得精子沉淀，区分高低活力精子；

8、5)用dpbs重复洗涤2遍,1500rpm离心15min，获得高低活力精子沉淀；

9、6)将精子沉淀用体细胞裂解液，室温裂解10min，去除残余体细胞，1500rpm离心10min，弃上清；

10、7)用无酶水配制的dpbs洗涤2遍，1500rpm离心10min，，进一步获得高活力和低活力精子沉淀；

11、s2精子rna提取及质量检测

12、1)用trizol重悬精子沉淀，添加100nm三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate，tcep)，70℃水浴30min，充分裂解精子；

13、2)加入0.2倍trizol体积的纯氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置2-3min，之后再12000rpm 4℃离心15min；

14、3)离心后将上层水相转移至新的无rna酶的离心管中，加入等体积的无水乙醇，震荡混匀；

15、4)按照rna提取试剂盒说明书进行总rna的提取；

16、5)将提取的精子rna进行电泳检测分析，并评估精子rna质量。

17、优选地，所述体细胞裂解液包括0.1％ sds和1m tris-hcl，ph为7.3。

18、本发明还公开一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，利用pirna转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性pirna，主要包括以下步骤，

19、s1 rna样品检测按照agilent公司核酸检测手册进行，主要包括：

20、1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度；

21、2)nanodrop检测rna的纯度；

22、3)qubit对rna浓度进行精确定量；

23、4)agilent 2100精确检测rna的完整性；

24、s2构建pirna文库，将pirna添加接头后进行逆转录，获得测序文库；

25、s3使用hiseq/miseq测序平台进行pirna测序；

26、s4 pirna的分析；

27、通过对测序得到的pirna序列比对到pirna数据库进行已知pirna分析，对未知的pirna进行从头预测。

28、优选地，通过分析od260/280比值判断nanodrop检测rna的纯度。

29、优选地，所述pirna数据库网址为http://pirnabank.ibab.ac.in/。

30、优选地，使用茎环法逆转录合成pirna的cdna，通用茎环序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac；pirna的逆转录引物如下所示：

31、

32、本发明还公开一种种公牛不同活力精子pirna检测方法的应用，包括用于评价公牛精子活力的功能性差异表达pirna以及分析不同活力精子中pirna组合表达。

33、优选地，采用实时荧光定量pcr分析不同活力精子中pirna组合表达，实时荧光定量pcr20μl反应体系为：10μl的2×real-time pcr master mix，正、反向引物各0.5μl，cdna1μl，8μl h2o；反应条件为：95℃3min；95℃，15s，57℃，15s，72℃，20s，40个循环。

34、优选地，所述实时荧光定量pcr检测中所使用的上游引物为的特异性引物,下游引物为根据茎环序列设计的通用下游引物：5’—agtgcagggtccgaggtatt--3'。

35、优选地，所述特异性荧光定量引物序列如下：

36、

37、本发明的有益效果是：

38、1、本发明建立了一种种公牛精子总rna提取方法，通过裂解精子过程中添加还原剂tcep，增加精子的裂解效果，提高精子rna的提取效率，增加rna的回收效果及rna的纯度，对研究精子rna提供提取方法；

39、2、同时基于此方法对提取的精子rna进行高通量转录组测序，鉴定出能够用于评估不同活力精子的pirna标记物，能够对公牛精子活力进行分子评价，填充公牛精液品质分子标记；

40、3、利用pirna转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性pirna的方法，这些pirna可以用于探究牛睾丸中精子的发生和精子活力形成原理，鉴定种公牛精子活力潜力，对于奶牛种公牛的分子选育具有重要的参考意义。