一种高效表达和纯化GABRB3蛋白的方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体的，本发明公开了一种高效高效表达和纯化gabrb3蛋白的方法及其应用。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)是由前体谷氨酸经过谷氨酸脱羧酶作用脱去α位上的羧基形成，是一种重要的抑制性神经递质。gaba受体有三种亚型，分别为gabaa受体、gabab受体、gabac受体，其中gabaa受体为离子型受体，在脑内主要存在的是gabaa受体。人源gabaa受体由19个基因编码，分别为α1-6，β1-3，γ1-3，δ，ε，θ，π，ρ1-3。gabaa受体有多种组成方式，其组成方式对其生理学和药理学性质均起着十分重要的作用，常见的组合为两个α亚基，两个β亚基及一个γ亚基。功能失调的gabaa受体直接参与许多神经系统疾病和精神疾病的发病机制,它不仅是有机氯类(氟虫腈，林丹、硫丹等)和阿维菌素类等杀虫剂的作用靶标，同时也是治疗人类癫痫，失眠，精神分裂症，酒精中毒，帕金森综合症等神经系统疾病的医药作用靶点，可以被gaba、苯二氮卓类、巴比妥类、神经活性类固醇、异丙酚、乙醇、苦味毒素、荷包牡丹碱等数百种药理学和临床上重要的化合物直接激活或抑制。gaba受体小分子激动剂适应症较广，应用需求高，基于药靶蛋白结构进行药物设计能提高药物研发的成功率。

2、β3亚基(gabrb3，gamma-aminobutyric acid type a receptor beta 3，subunitgene)可以有效的组装成功能性同源五聚体，是gaba受体中研究较多、功能显著的一种，其基因的缺失、重复和变异会引起许多人类神经发育障碍和综合征，如天使人症候群、普瑞德威利症候群、非综合征型面部裂隙、癫痫和自闭症等。然而，由于缺乏高质量的gabrb3蛋白晶体，gabrb3的结构尤其是电镜下结构尚不清晰，gabrb3的激动剂的筛选，以及gabrb3与小分子激动剂的复合物的电镜结构解析也存在障碍。

技术实现思路

1、为了获得高质量表达的gabrb3蛋白以及高纯度的蛋白，本发明提供一种提高gabrb3蛋白表达的方法，并且通过优化streptavidine(链霉亲和素)亲和柱和凝胶过滤层析的缓冲液(buffer)，获得了产量较高、质量较好的蛋白，为筛选小分子激动剂、冷冻电镜结构解析和后续体内药性毒性初步评价提供了获得所需要的蛋白量的解决方案。

2、本发明的一个方面，本发明提供了一种重组gabrb3蛋白表达方法，所述方法包括：利用昆虫细胞sf21表达gabrb3蛋白，在表达过程中调整表达温度从27℃到30℃以提高蛋白的表达量。

3、在本发明中：所涉及的重组gabrb3蛋白序列如seq id no.1所示，其中，结尾部分的氨基酸序列wshp qfekgggsgg gsggsawshp qfek为标签twin-strep ii的蛋白序列。

4、重组gabrb3的基因序列如seq id no.2所示，其可以通过基因合成获得。合成后的基因序列经测序验证与目标序列完全一致，然后将测序正确的序列构建在pfastbac1表达载体上。

5、其中，tg gagccaccct cagttcgaaa agggtggtgg cagcggtggc ggttccggcggttctgcttg gagccaccca cagttcgaga ag为标签twin-strep ii的蛋白的核苷酸序列，最后两个tga为终止密码子。

6、在本发明中，蛋白表达为将已制备好的杆状病毒先在27℃条件下感染细胞8小时，然后将温度调整为30℃，表达72小时后收取细胞以制备重组gabrb3蛋白。

7、本发明的一个方面，本发明提供了一种表达gabrb3蛋白的重组表达载体，所述重组表达载体为含有gabrb3蛋白基因的pfastbac1载体。所述gabrb3蛋白基因序列如seq idno.2所示。

8、本发明的一个方面，本发明提供了一种重组gabrb3蛋白，所述重组gabrb3蛋白的c端带有twin-strep ii标签，其蛋白序列如seq id no.1所示。

9、本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化重组gabrb3蛋白的方法，所述方法包括：

10、(1)将表达重组gabrb3蛋白的细胞，在缓冲液存在的条件下匀浆破碎；优选的，所述重组gabrb3蛋白的序列如seq id no.1所示；

11、(2)离心收集细胞沉淀，溶解膜，离心收集上清；

12、(3)使用亲和层析柱富集纯化蛋白；

13、(4)凝胶过滤层析柱进一步纯化蛋白；优选的，所述亲和层析柱为xt；凝胶过滤层析柱的型号为superose 200increase 10/300gl；

14、其中，亲和层析所使用的平衡缓冲液为10mm hepes ph 7.5，150mm nacl，0.01％lmng，0.001％ chs；洗脱缓冲液为10mm hepes ph 7.5，150mm nacl，0.01％ lmng，0.001％chs，75mm biotin；凝胶过滤层析缓冲液为(sec buffer):10mm hepes ph 7.2，150mmnacl，0.007％(w/v)lmng，0.0006％(w/v)chs。

15、本发明的一个方面，本发明的gabrb3蛋白表达和/或纯化方法可以用于制备应用于冷冻电镜结构解析中的gabrb3蛋白。

16、本发明的一个方面，本发明制备获得的重组gabrb3蛋白可以用于与gabrb3蛋白结合的小分子激动剂的筛选中；可以用于冷冻电镜gabrb3蛋白结构解析中，也可以用于gabrb3与小分子激动剂复合物电镜结构解析。

17、本发明的一个方面，本发明提供了重组gabrb3蛋白的高分辨率冷冻电镜结构，所述结构的分辨率为解析后的结构为同源五聚体，所述重组gabrb3的蛋白序列如seqid no.1所示。

18、有益效果：

19、本发明构建了gabrb3蛋白的高效表达载体，优化了表达体系条件，开发了纯化方法，获得了大量的高纯度的重组gabrb3蛋白，为与该蛋白结合小分子药物的筛选、开发奠定了基础。

20、本发明成功得到了整体分辨率为的gabrb3同源五聚体结构，较现有报道的单独gabrb3蛋白结构的分辨率更高，更适合小分子激动剂的筛选实验，为研究该蛋白受体和小分子激动剂复合物冷冻电镜结构的解析提供了基础。

技术特征：

1.一种重组gabrb3蛋白表达方法，其特征在于，所述方法包括：利用昆虫细胞sf21表达gabrb3蛋白，在表达过程中调整表达温度从27℃到30℃以提高蛋白的表达量；

2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，将已制备好的杆状病毒感染sf21细胞后，先在27℃条件下感染细胞8小时，然后将温度调整为30℃，表达72小时后收取细胞以制备重组gabrb3蛋白。

3.一种表达gabrb3蛋白的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为含有gabrb3蛋白基因的pfastbac1载体，所述gabrb3蛋白基因序列如seq id no.2所示。

4.一种重组gabrb3蛋白，其特征在于，所述重组gabrb3蛋白的c端带有twin-strep ii标签，其蛋白序列如seq id no.1所示。

5.一种纯化重组gabrb3蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

6.重组gabrb3蛋白在冷冻电镜结构解析gabrb3蛋白中的应用，其特征在于，通过权利要求1和/或权利要求5的方法得到用于冷冻电镜结构解析gabrb3蛋白。

7.一种重组gabrb3蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的表达和纯化方法所获得重组gabrb3蛋白在与gabrb3蛋白结合的小分子激动剂的筛选中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于与gabrb3与小分子激动剂复合物电镜结构解析。

10.一种重组gabrb3蛋白的高分辨率冷冻电镜结构，其特征在于，所述结构的分辨率为解析后的结构为同源五聚体，所述重组gabrb3的蛋白序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明公开了一种高效表达和纯化GABRB3蛋白的方法及其应用。本发明通过构建表达GABRB3蛋白的pFastBac1载体，并且优化表达条件，大大提高了GABRB3蛋白的表达量。在纯化过程中通过使用亲和层析，并优化层析缓冲液，提高了蛋白的纯度，获得了均一性更好的GABRB3蛋白。本发明制备的蛋白可以用于与该蛋白结合的小分子激动剂的筛选，为GABRB3蛋白结构、该蛋白与小分子激动剂复合物电镜结构解析提供了良好的条件。

技术研发人员：胡熠凡,颜晓东,桂文君,杨益虎,曹昇
受保护的技术使用者：无锡佰翱得生物科学股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24