碱性蛋白酶变体及其应用的制作方法

本公开涉及基因工程和酶工程领域，特别是涉及一种新型的碱性蛋白酶变体及其应用。

背景技术：

0、发明背景

1、在进入20世纪80年代后，随着科学技术的发展和环保意识的进一步增强，洗涤剂工业领域除了积极开发各种高效、温和的表面活性剂和助剂外，还会通过加入酶制剂来提高去污能力，根据酶制剂的不同一般可提高30％-60％，同时还能降低表面活性剂及三聚磷酸盐的用量。洗涤剂中的酶多为水解酶，其中，碱性蛋白酶是洗涤剂领域中应用最早，数量最多的一类水解酶。

2、碱性蛋白酶(alkaline protease)属于丝氨酸蛋白水解酶家族，具备典型的ser-his-asp催化三联体结构，可以在碱性条件下(ph为7～11)保持酶活力，并催化水解蛋白质。由于细菌碱性蛋白酶具有重要的工业应用价值，在商品酶的生产中占有相当大的份额，所以目前工业化生产的碱性蛋白酶多来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。

3、虽然在洗涤剂中添加碱性蛋白酶能显著提升洗涤效果，但是洗涤剂中的多种组分都会影响到碱性蛋白酶的活性，例如，漂白剂组分会氧化蛋白酶中蛋氨酸残基导致酶失活；洗涤剂中的无机盐(如三聚磷酸钠、碳酸钠、硼酸钠等)、烷基苯磺酸钠等活性物质的存在都会对酶活性产生不利影响。而细菌来源的野生型碱性蛋白酶在耐热性、耐表面活性剂、储藏稳定性等方面难以满足实际应用需求。目前商用的碱性蛋白酶，如诺维信公司的progressuno 100/100l、美国杜邦公司的p300等都是野生型蛋白酶的变体。虽然商品酶的稳定性有了很大提升，但有些蛋白酶制剂中仍需添加一定量价格高昂的蛋白酶抑制剂来维持稳定性。因此，还需要继续采用先进的蛋白工程和基因技术，如酶分子定向进化、理性设计等手段来提升酶的关键性能，获得稳定性高且更具实际应用价值的碱性蛋白酶。

技术实现思路

1、第一方面，本公开提供碱性蛋白酶变体，其氨基酸序列与seq id no：29所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％但小于100％的序列一致性，并且包含a)x9e、x42r、x199i、x256e、x69i、x139y、x141y、x206n和x134q的氨基酸取代；和b)选自x143q或x142n的氨基酸取代。

2、在一些实施方案中，所述变体还包含选自x15c、x16c、x102i、x209n、x218a、x250p、x258c或x264c中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。

3、在一些实施方案中，所述变体还包含选自x15c、x16c、x102i、x209n、x218a、x250p、x258c或x264c中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。

4、在一些实施方案中，所述变体包含a)s9e、n42r、v199i、l256e、t69i、s139y、t141y、s206n和e134q的氨基酸取代；和b)选自r143q或s142n的氨基酸取代。

5、在一些实施方案中，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。

6、在一些实施方案中，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。

7、在一些实施方案中，所述变体包含a)s9e、n42r、v199i、l256e、t69i、s139y、t141y、s206n、和e134q的取代；和b)选自r143q或s142n的氨基酸取代；和任选地c)选自下述任一的氨基酸取代组：

8、1)t218a；

9、2)a16c+a264c；

10、3)t218a+s250p；

11、4)a15c+t218a+g258c；

12、5)v102i+t218a+s250p；

13、6)v102i+a209n+t218a+s250p；

14、7)a16c+v102i+t218a+s250p+a264c；或

15、8)a15c+v102i+a209n+t218a+s250p+g258c。

16、其中，本公开所述的“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

17、在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列包含seq id no：1-14中任一所示。在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列为seq id no：1-14中任一所示。本公开还提供一种变体，所述变体的氨基酸序列与seq id no：1所示序列相比具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，所述变体序列包含seq id no：1或由其组成。

18、在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸的取代。在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中的一个、两个、三个或四个氨基酸的取代。

19、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含t218a的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：2或由其组成。

20、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：3或由其组成。

21、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含v102i、t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：4或由其组成。

22、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含v102i、a209n、t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：5或由其组成。

23、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含a16c和a264c的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：11或由其组成。

24、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：1，包含a15c、t218a和g258c的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：12或由其组成。

25、本公开还提供一种变体，所述变体的氨基酸序列与seq id no：6所示序列相比具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，所述变体序列包含seq id no：6或由其组成。

26、在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自a15c、a16c、v102i、a209n、t218a、s250p、g258c或a264c中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。

27、在一些实施方案中，所述变体序列相对于seq id no：6，包含t218a的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：7或由其组成。

28、在一些实施方案中，所述变体相对于seq id no：6，包含t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：8或由其组成。

29、在一些实施方案中，所述变体相对于seq id no：6，包含v102i、t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：9或由其组成。

30、在一些实施方案中，所述变体相对于seq id no：6，包含v102i、a209n、t218a和s250p的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：10或由其组成。

31、在一些实施方案中，所述变体相对于seq id no：6，包含a16c、v102i、t218a、s250p和a264c的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：13或由其组成。

32、在一些实施方案中，所述变体相对于seq id no：6，包含a15c、v102i、a209n、t218a、s250p和g258c的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含seq id no：14或由其组成。

33、在一些实施方案中，所述变体与野生型蛋白酶(seq id no：29)相比，具有一种或多种改善的特性。该特性包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、ph活性、ph稳定性、聚酯降解活性、聚酯特异性、蛋白水解稳定性、溶解度、比活性、在储存条件下的稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性和热稳定性等。

34、在一些实施方案中，所述蛋白酶变体具有改善的热稳定性，该变体在85℃，10min孵育处理后仍具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％的初始蛋白酶活性。

35、第二方面，本公开还提供编码上述任一碱性蛋白酶变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含信号肽编码序列、和/或前导肽编码序列、和/或标签肽编码序列；其中所述信号肽是指可参与成熟蛋白或前体蛋白的分泌或直接转运的氨基酸残基；所述前导肽序列是指位于信号肽与成熟多肽序列间的氨基酸序列，将其切除后能获得有活性的蛋白酶；所述标签肽可用于蛋白质的纯化和示踪等。

36、在一些实施方案中，所述多核苷酸序列如seq id no：15-28中任一所示。

37、第三方面，本公开还提供重组表达载体，包含本公开所述的多核苷酸序列，其中所述重组表达载体可为直链或环状dna分子。在一些实施方案中，所述重组表达载体上还具有可操作的连接至dna序列以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列。在一些实施方案中，所述重组表达载体上还包含转录终止序列。

38、第四方面，本公开还提供制备上述变体的方法，包括：(1)用上述表达载体转化宿主细胞，并诱导宿主细胞表达蛋白酶变体；(2)回收蛋白酶变体。

39、第五方面，本公开还提供一种包含至少一种本公开所述的蛋白酶变体的清洁或洗涤剂组合物。

40、在一些实施方案中，所述组合物中还包含一种或多种辅助成分，包括但不限于表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂等。

41、在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的酶，可任选自中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、过水解酶、氧化酶和过氧化物酶等。

42、在一些实施方案中，所述组合物中的蛋白酶变体相对于野生型蛋白酶(seq idno：29)具有增强的储藏稳定性。在一些实施方案中，所述组合物在60℃储存一段时间后(例如，至少6h、至少8h、至少12h、至少16h、至少24h、或至少36h后)，其中的蛋白酶变体仍具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、或至少70％的初始蛋白酶活性。在一些实施方案中，所述组合物在37℃储存一段时间后(例如，至少1周后、至少2周后、至少3周后、至少4周后、或至少5周后)，其中的蛋白酶变体仍具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的初始蛋白酶活性。

43、第六方面，本公开还提供如本公开所述碱性蛋白酶变体或包含如本公开所述碱性蛋白酶变体的组合物在清洁或洗涤中的用途。

44、第七方面，本公开提供用于清洁或洗涤物品的方法，包括利用本公开所述的蛋白酶变体或组合物与物品接触。

45、本公开所述的碱性蛋白酶及其变体对应的氨基酸序列如表1所示：

46、表1

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50、有益效果

51、1、本公开通过对源自alkalihalobacillus alcalophilus的碱性蛋白酶进行改良，筛选获得热稳定性能优势的突变体，有助于拓展碱性蛋白酶的使用范围，为其更好的适应工业化生产奠定了基础，对降低蛋白酶的使用成本具有重要意义；

52、2、本公开提供的蛋白酶变体能够在不含有蛋白酶抑制剂的洗涤剂中长时间稳定存在，在满足产品保质期的同时降低了产品成本。