一种用于防治黄瓜花叶病毒的纳米分子CP2b-RNAsquare及其制备方法和应用

本发明涉及一种纳米分子cp2b-rnasquare及其制备方法和应用，更具体一点说，涉及一种用于防治黄瓜花叶病毒的纳米分子cp2b-rnasquare及其制备方法和应用，属于生物基因工程领域。

背景技术：

1、黄瓜花叶病毒(cmv)是黄瓜病毒科黄瓜病毒属最常见的植物病原病毒之一。它在温带地区广泛而常见，影响40个双子叶和单子叶科的1200多个不同物种，给许多蔬菜和观赏作物造成重大经济损失。它由60多种蚜虫非持续性传播。除了葫芦科植物，严重的cmv病毒感染发生在例如菠菜、番茄、胡萝卜、欧芹、芹菜、甜菜根、豌豆、甘蓝、生菜、烟草、菊花、郁金香、天竺葵、剑兰、百合、旱金莲和夹竹桃。cmv病毒影响广泛，被侵染的的植株可表现为花叶、矮化、坏死等症状，具有导致作物减产，死亡的严重后果。cmv病毒含有三条rna链的rna病毒，rna1上的1a蛋白和rna2上的2a蛋白均与病毒的复制有关；rna2的2b蛋白影响病毒的全身感染，抑制病毒介导的基因沉默；rna3上有mp(3a)和cp蛋白，mp(3a)控制病毒在细胞间移动和在植株内长距离移动；cp是衣壳蛋白，是蚜虫媒介传播的唯一决定因子。由于一般化学药物很难破坏病毒粒子的结构，因此目前生产上尚无理想的药物可以用于包括cmv在内的各种植物病毒的防控。

2、大量研究发现，外源性双链rna(dsrna)通过喷洒可以被植物吸收后，进一步被加工成小干扰rna(sirna)，通过rnai途径诱导具有互补序列的靶基因沉默。这一发现导致了喷雾诱导基因沉默(sigs)的产生，其中病毒关键基因靶向的dsrna或sirna被局部应用于植物材料，可以为植物提供安全而强大的保护作用，以对抗病毒的感染。因此，基于sigs的rna具有精准、高效、绿色无污染等优势，受到了植物保护专家的高度重视，将其称为“农药史上的第三次革命”，在作物病害防治领域具有巨大的应用潜力。然而，由于rna本身环境稳定性差，易降解、植物吸收效率低下等特点，导致直接喷施裸露的dsrna或sirna时，存在rnai诱导效率低，作用时间短等缺陷，因此这种通过sigs的效应在应用中需要递送载体，以提高dsrna/sirna的吸收效率，否则只有在连续供应dsrna时才能维持。因此，选用合适的载体以提高dsrna/sirna递送效率和以及rnai诱导效率是当前rnai生物农药面临的关键问题。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术问题，提供一种可同时靶向cp和2b两个cmv关键基因且具有四边形的rna纳米分子——cp2b-rnasquare，及其cp2b-rnasquare的制备方法和应用。

2、通过将靶向cp和2b基因的dsrna/sirna作为正方形rna纳米颗粒的一部分，借助rna纳米颗粒所具备的良好的稳定性以及高效的细胞穿透性，以提高dsrna/sirna的rnai触发效率，增强对cmv的防治能力。

3、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

4、本发明一种用于防治黄瓜花叶病毒的纳米分子cp2b-rnasquare，其特征在于：所述cp2b-rnasquare为rna纳米分子，其序列为seq no.1；

5、所述seq no.1：

6、gggacgguggaggguuguugcuaccugguugauggguugguagccucccgcggcgaacuaguagggg

7、acugcucgcggccgcccuaacaggugaagggcggucgcgaguaguccuuuaucgccgugggaggcuac

8、caauucauuugugaauaacggugagaacugggagguuauacucuucuuaugauacguuaacaaaguua

9、cuggaugcuagagaguuaccauugauguaugaaaugaagaaagugggcuuguacuuugcaauccgcag

10、ccgguugagugcagaaauccggcaacaccugagccggguuucugcacucggccggcuaacuagcggau

11、ugcggagugcgagcccgcuuucuucguuucaugcgucaguggugaacuaacucucuggcguccagugg

12、cuuuguugacgugucguagggaggguguagcaacuacucccgguucucaccguuguucgcaaaucagguaguaacaaccuuuuaccgucc。

13、优选的，所述cp2b-rnasquare纳米分子能够通过局部碱基互补配对折叠形成具有正方形结构的rna纳米分子。

14、本发明一种用于防治黄瓜花叶病毒的纳米分子cp2b-rnasquare的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

15、步骤1)编码cp2b-rnasquare的dna模板的合成：

16、根据cp2b-rnasquare的序列，推导出其编码的dna模板序列，并在模板序列上游插入t7启动子序列，将这条编码cp2b-rnasquare的模板dna序列进行化学合成获得合成片段；

17、步骤2)cp2b-rnasquare的合成：

18、将合成片段插入到pet28a载体的bgl ii和bpu1102 i的位点之间，得到能够在大肠杆菌体内经诱导表达获得cp2b-rnasquare的重组质粒；

19、步骤3)cp2b-rnasquare在大肠杆菌中的诱导表达：

20、将重组质粒转化进入大肠杆菌，挑取阳性重组克隆利用lb液体基，在37°c扩大培养至od值达到0.4，加入iptg诱导4小时，获得诱导好的菌体，并放在4℃冰箱保存；

21、步骤4)cp2b-rnasquare的分离提取：

22、离心收集诱导好的菌体，加入1/10体积的rna提取液，加入等体积的水饱和酚以裂解细菌和变性蛋白质，离心10min后，取上清至新管，加入等体积氯仿混匀后，再离心10min后，取上清得到cp2b-rnasquare分子的溶液。

23、优选的，将步骤4)中cp2b-rnasquare分子的溶液稀释为500ng/ul能够用于cmv的防治实验。

24、优选的，用于cmv的防治实验包括：

25、将步骤4)中cp2b-rnasquare分子的溶液稀释到500ng/ul，按照2ml/棵的用量将cp2b-rnasquare喷洒到整棵烟草植物上，1天后再利用摩擦接种的方法将cmv病毒接种到喷洒了cp2b-rnasquare的烟草叶片上，在24℃继续培养21天后，观察cp2b-rnasquare的抗病毒效果。

26、本发明一种纳米分子cp2b-rnasquare在用于防治黄瓜花叶病毒的药物中的应用。

27、有益效果：能够提高dsrna/sirna的rnai触发效率，实现增强对cmv的防治能力，能够为植被正常生长提供有效的保护，提高经济效益；可利用大肠杆菌中进行大规模可持续生产，而且抗病毒的效果良好，成功解决了目前对cmv无药可用的困境。