一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用与流程

本发明属于基因工程，具体涉及一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用。

背景技术：

1、透明质酸，(hyaluronan或hyaluronic acid,ha)又叫玻尿酸，是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖，由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的。透明质酸酶是可以降解透明质酸的一类酶，可高效制备低分子量的透明质酸寡糖。在市场应用方面，透明质酸酶可广泛应用于美容、医药器械、制剂、原料药等多种医药领域。

2、目前市面售卖的透明质酸酶多以提取法从动物睾丸中经提取获得，虽然已经建立了适合于医药领域成型的透明质酸酶提取制备工艺，并获得了具有酶活性的透明质酸酶蛋白，但该工艺的透明质酸酶的蛋白产量较低，提取中大量使用有机化学试剂，且生产成本较高，获得透明质酸酶往往工艺成本较高且操作繁琐，且在应用中可能有交叉感染动物病毒的风险。

3、国内外以生物手段制备透明质酸酶的研究已有一定成效，通过枯草芽孢杆菌、大肠杆菌制备透明质酸酶的研究已有报道，中国专利cn200810134513.6利用大肠杆菌表达获得具有酶活性的透明质酸酶蛋白，但表达产物位于菌体内，导致分离纯化工艺复杂，影响产量且增加了成本和污染风险；中国专利cn201410555212.6利用枯草芽孢杆菌进行透明质酸酶的制备，但枯草芽孢杆菌表达的拷贝数通常较少，相比酵母而言表达量更低，存在转化困难、遗传操作复杂等缺点。

4、工业生产需求对透明质酸酶的需求仍十分巨大，为实现透明质酸酶的工业化前景，市场对透明质酸酶的酶活力有了更高的期待，且通过发酵罐高密度发酵的透明质酸酶具有一定的价格和纯度优势，且酵母在医药、美容、食品等多重领域的认可度较高，更易被消费者接受。

5、传统的毕赤酵母表达透明质酸酶的工艺中，需要在甲醇的严格诱导下才能表达出透明质酸酶，然而在工厂的放大工艺中有一定的隐患：甲醇有毒易燃，需要进行防爆车间；消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；甲醇作为一种石油化学产品，不适合于一些食品领域添加剂的生产，随着石油危机的爆发，利用甲醇生产成本变高；甲醇代谢产生的h2o2，对发酵也有一定的影响。中国专利文献cn201310597818.1和cn202110245290.6，是利用甲醇作为诱导剂。

6、透明质酸的生物学功能和特异性应用取决于其分子质量，高分子透明质酸结构稳定，具有锁水性强、粘性高、流动性弱等优点，低分子透明质酸可保持关节润滑，长久保湿，在骨关节炎治疗中有显著疗效；小分子透明质酸能渗入真皮层，扩张毛细血管，在化妆品领域有着广泛应用。而透明质酸寡糖具有独特的生物学活性功能，如可以刺激成纤维细胞增殖、胶原合成以及选择性杀死癌细胞等作用，透明质酸寡糖在食品保健以及医药领域具有重要的应用前景，与物理法和化学法相比，用透明质酸酶进行水解的方法来制备不同聚合度的寡聚透明质酸具有反应温和、无毒无害、重复性好等优点。市场中以透明质酸酶进行酶法制备透明质酸寡糖的应用多从β(1-3)或β(1-4)糖苷键中的其中一种位置进行断裂，产生的水解产物绝大多数为偶数寡糖，如六糖、八糖等如中国专利申请cn103484513a、申请号202110937316.3。目前，未有成功案例使用一种酶进行奇数透明质酸寡糖的制备研究。

7、进一步的，现有技术中从β(1-3)和β(1-4)位点进行水解透明质酸时，需要两步添加两种酶液，且这两种酶液一为水解酶，另一种为提取法制备的裂解酶，该方法的缺点是，如果想制备这两种酶液，需要两次制备：发酵一次β(1-3)水解酶，再提取一次β(1-4)酶，较为繁琐，且提取法制备的β(1-4)酶，工艺繁琐，若直接购买，则价格昂贵，不适用于工厂大型应用。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用。

2、一种透明质酸酶融合蛋白，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示。

3、上述透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.5所示。

4、一种酵母工程菌，所述酵母工程菌为在酵母菌中导入透明质酸酶融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5、根据本发明优选的，所述酵母菌为毕赤酵母菌。

6、一种pichia pastoris haase(an)-his-9k-gs115，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号是cctcc no：m20231485，保藏日期2023年08月15日。

7、上述酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

8、(1)将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列seq id no.5以同源重组的手段插入至ppic9k载体中的ecori和noti酶切位点之间，得到重组质粒ppic9k-haase-fus；

9、(2)将透明质酸酶融合蛋白的编码基因序列seq id no.5以同源重组的手段插入pgapzαa载体中，得到重组质粒pgapzαa-haase-fus；

10、(3)使用限制性内切酶sali对步骤(1)得到的重组质粒ppic9k-haase-fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌p.pastoris/ppic9k-haase-fus；

11、(4)使用限制性内切酶avrii对步骤(2)得到的重组质粒pgapzαa-haase-fus进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入步骤(3)获得工程菌p.pastoris/ppic9k-haase-fus的感受态细胞中，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌p.pastoris/ppic9k-haase-fus/pgapzαa-haase-fus。

12、根据本发明优选的，步骤(3)中，毕赤酵母为毕赤酵母gs115。

13、根据本发明优选的，步骤(3)中，利用md培养基培养后，在含遗传霉素g418的培养基进行筛选。

14、根据本发明优选的，步骤(4)中，利用含博来霉素的培养基进行筛选。

15、上述酵母工程菌、pichia pastoris haase(an)-his-9k-gs115在制备透明质酸酶融合蛋白中的应用，所述透明质酸酶融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

16、上述酵母工程菌、pichia pastoris haase(an)-his-9k-gs115在降解透明质酸中的应用。

17、上述酵母工程菌、pichia pastoris haase(an)-his-9k-gs115在生产奇数透明质酸寡糖中的应用。

18、根据本发明优选的，所述奇数透明质酸寡糖包括三糖、五糖、七糖、九糖。

19、本发明的有益效果如下：

20、1、本发明首次将水蛭透明质酸酶与山大齿猛蚁透明质酸酶融合形成了一种新酶，即融合蛋白酶，发明人将该融合蛋白酶的编码基因序列重组到毕赤酵母菌的基因组中得到毕赤酵母工程菌，发明人发现毕赤酵母工程菌不仅能够有效表达该融合蛋白，并且表达的融合蛋白具有较高的酶活性，而且具有两种酶的活性，能够同时从β(1-3)和β(1-4)位点进行水解，有效降解透明质酸产生奇数透明质酸寡糖，包括三糖、五糖、七糖、九糖等。

21、2、本发明还构建了一株高产透明质酸酶融合蛋白的毕赤酵母工程菌，进一步提高了融合蛋白的酶活，摇瓶阶段达153386u/ml，发酵罐进行高密度发酵后，酶活达到1243462.72u/ml，同时，该高产透明质酸酶融合蛋白重组菌株既可以用甲醇进行诱导，也可以使用甘油进行诱导，在工业化生产中可选择不同的诱导剂进行发酵；甘油诱导的方式可大大提高实际操作中的安全性，同时可以降低对环境的危害。

22、3、发明人还发现毕赤酵母工程菌与毕赤酵母对照菌的生长速度几乎一样，即将融合蛋白酶的编码基因序列重组到毕赤酵母菌的基因组中，进行表达，没有影响毕赤酵母的生长。

23、4、本发明构建的透明质酸酶融合蛋白能够为体外制备低分子透明质酸提供新的策略，实现了利用毕赤酵母重组转化子分泌表达透明质酸酶的策略，为重组透明质酸酶的工业化生产奠定了基础，可以大量生产获得亲水性好、结构完整、功能优异的透明质酸酶蛋白，并用作化妆品、医疗美容等产品的原料；本发明制备得到的奇数透明质酸寡糖，不仅丰富了寡糖结构的多样性，而且对于开展不同结构类型的透明质酸寡糖与疾病的发生、发展的关系等具有十分重要的意义。