一种通过限糖策略在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和二十二碳六烯酸的方法和应用与流程

本发明属于微生物，尤其是一种通过限糖策略在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和二十二碳六烯酸的方法和应用。

背景技术：

1、裂殖壶菌是属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类缺乏叶绿体的海洋单细胞异养型真菌。裂殖壶菌具有生长周期短，培养简单的特点，由于其富含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,pufas)，特别是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,dha)，因此被认为是工业化生产dha最具潜力的微生物。由于裂殖壶菌在生产pufas时，乙酰辅酶a是最重要的前体物质，而裂殖壶菌体内存在的甲羟戊酸(mva)途径合成多种萜类物质时也是以乙酰辅酶a作为前体物质，因此，裂殖壶菌在生产脂肪酸时，也会生产β-胡萝卜素等萜类化合物。

2、β-胡萝卜素(c40h56)是类胡萝卜素家族的一员，对动物机体生理机能的调节起着重要作用。β-胡萝卜素具有促进血管生成、抗癌和抗炎作用。由于人体无法合成β-胡萝卜素，故必须从饮食中获取。β-胡萝卜素是维生素a的前体，广泛应用于食品添加剂和营养补充剂。天然β-胡萝卜素具有很高的生物活性，可用于治疗眼科疾病、抗氧化、抗衰老、抗癌和增强免疫功能等。植物和微藻均可合成β-胡萝卜素，微生物发酵法具有生长繁殖快、产量高、培养方法简单、经济效益高等特点，利用微生物来生产β-胡萝卜素被认为是一种很有潜力的方法。

3、近年来，随着合成生物学的发展，经过代谢工程改造的微生物底盘细胞已成为绿色、经济生产高价值萜类的重要平台之一。现有技术中，专利公开文献cn202310040256.4中报道了在解脂耶氏酵母中引入合成途径，再增加crtb，crti，crty基因的拷贝数以及与甲羟戊酸(mva)途径相关的基因ggs1、hmg的过表达，以及启动子的优化地提高了β-胡萝卜素的产量；专利公开文献cn202310575381.5以枯草芽孢杆菌为出发菌株，在基因组上整合了强启动子pveg表达β-胡萝卜素合成相关途径基因焦磷酸合酶基因crte，八氢番茄红素合成酶基因crtb和八氢番茄红素脱氢酶基因crti，得到番茄红素生产菌株g600ebi；使用脱水四环素诱导型启动子ptet来表达番茄红素环化酶基因crty，得到β-胡萝卜素生产菌株等，这些在微生物中通过基因工程手段改造菌株生产β-胡萝卜素的策略相比发酵策略而言所需时间周期长，人力物力消耗大，不够经济实惠。而专利公开文献cn202111452684.5、cn202111452693.4是通过诱变育种以及对原生质体进行细胞融合和再生等手段获得能够积累β-胡萝卜素的有效菌株，也是一种有效的策略，能够获得更多高产β-胡萝卜素的新型菌株，但相比发酵策略而言，技术要求更高，操作更加复杂。裂殖壶菌作为最具潜力的工业化生产dha的底盘菌株，若能在不影响dha高产的前提下，实现β-胡萝卜素的高产，将会全面提高裂殖壶菌的应用价值。目前，通过限糖策略在裂殖壶菌菌株中联产β-胡萝卜素和dha未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种通过限糖策略在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和二十二碳六烯酸的方法和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种在发酵生产过程中通过限糖策略在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和二十二碳六烯酸的方法，所述方法是在裂殖壶菌发酵过程中停止补糖以联产β-胡萝卜素和dha。

4、进一步地，所述方法是在裂殖壶菌发酵过程中，于第2天、第4天、第6天停止补糖以联产β-胡萝卜素和dha。

5、进一步地，包括以下步骤：

6、(1)将裂殖壶菌菌株接种于种子培养基中进行活化，并将得到的活化菌转接于种子培养基以获得一代种子；

7、(2)将步骤(1)获得的一代种子接种于种子培养基中再次培养获得二代种子；

8、(3)将步骤(2)中获得的二代种子接种于种子培养基中再次培养获得三代种子；

9、(4)将步骤(3)的三代种子转接于发酵培养基中进行发酵培养；

10、(5)将步骤(4)中的发酵液分别于不同时间点停止补糖进行发酵，共发酵10天。

11、进一步地，步骤(1)至(3)的种子的培养方法为：将裂殖壶菌、一代种子、二代种子接种于种子培养基中，接种量为0.8％-1％(v/v)，28-30℃，170-200rpm下培养20-24h。

12、进一步地，步骤(1)至(3)的种子的培养方法为：将裂殖壶菌、一代种子、二代种子接种于种子培养基中，接种量为0.8％(v/v)，温度为28℃，转速为200rpm下培养24h。

13、进一步地，步骤(4)中将步骤(3)中培养到对数期的三代种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，接种量为0.8％-1％(v/v)，28-30℃，170-200rpm下培养20-24h。

14、进一步地，步骤(4)中将步骤(3)中培养到对数期的三代种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，接种量为0.8％(v/v)，温度为28℃，转速为200rpm下培养。

15、进一步地，所述种子培养基为：d-葡萄糖40g/l、酵母膏2g/l、谷氨酸钠10g/l、mgcl23g/l、cacl2·2h2o 1g/l、kh2po44g/l、kcl 2g/l、nacl 15g/l、mgso4·7h2o 5g/l、fecl30.1g/l；

16、发酵培养基为：d-葡萄糖40g/l、酵母膏2g/l、谷氨酸钠10g/l、mgcl23g/l、(nh4)2so46g/l、kh2po44g/l、kcl 2g/l、nacl 15g/l、mgso4·7h2o 5g/l、fecl30.1g/l。

17、进一步地，步骤(5)中不同时间点为于发酵过程的第2天、第4天、第6天停止补糖。

18、如上所述的方法在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和dha中的应用。

19、本发明取得的优点和积极效果为：

20、1、本发明首次提出了限糖策略可以控制裂殖壶菌发酵过程中β-胡萝卜素和dha的含量，这种限糖策略就是在发酵过程中的某个时间停止补糖，不同时间停止补糖的实验组中均能实现裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和dha。本发明通过在裂殖壶菌发酵体系中停止补糖，以至于饥饿状态下产生的大量ros，通过生产β-胡萝卜素来降低。该限糖策略可以实现裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和dha。

21、2、本发明通过简单的发酵调控，可在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和dha，且该方法生产成本低，具有较大的经济效益。

22、3、本发明提供一种裂殖壶菌联产β-胡萝卜素和dha的发酵策略——限糖，该策略首次被应用到调控裂殖壶菌β-胡萝卜素和dha含量中，细胞处于饥饿状态会产生大量活性氧(ros)，而β-胡萝卜素是很强的抗氧化剂，其抗氧化能力和维生素c相当，因此饥饿状态下，裂殖壶菌会为了缓解产生的ros而增加β-胡萝卜素的合成。本发明在裂殖壶菌的发酵过程中的不同时间点停止补糖来检测β-胡萝卜素和dha的产量。本发明是一种实现在裂殖壶菌中联产β-胡萝卜素和dha的方法，简单高效、价格低廉且安全。

23、4、本发明提供的是一种简单的发酵调控策略，与现有技术中通过各种基因工程改造获得工程菌后再进行发酵的策略相比，周期更短，操作更加方便，更加具有经济效应，同时也能应用于各种工程菌的发酵调控之中。