一种鉴定水稻中胚轴长度的分子标记及其应用

本发明涉及育种，尤其涉及一种鉴定水稻中胚轴长度的分子标记及其应用。

背景技术：

1、随着基因组学和分子生物学的不断进步，单核苷酸多态性(snp)标记和重测序技术在水稻遗传研究中得到了广泛应用。这些技术为水稻复杂性状遗传解析研究提供了强有力的工具，包括高密度遗传图谱构建、数量性状基因定位、全基因组选择和种质基因型检测等。

2、在基因分型技术中，pcr(聚合酶链式反应)是一种广泛使用的技术，它能够扩增特定的dna片段并进行定性或定量分析。然而，传统的pcr方法在应用于水稻遗传基因分型时，可能会遇到一些问题。首先，由于水稻基因组的复杂性和多态性，传统的pcr方法可能无法准确检测某些snps或indels。其次，传统的pcr方法通常需要大量的dna样本和繁琐的实验步骤，这可能会增加实验成本和时间。

3、kasp(kompetitive allele-specific pcr)技术是一种对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断的分子标记技术。英国lgc genomics公司研发的基于kasp技术的snp基因分型检测方案，能够有效节约成本，并高效应用于大批量材料的特异标记检测工作，从而有效促进水稻分子辅助育种进程。

4、在实践中，通过应用kasp技术对水稻种质资源进行基因分型检测，可以快速筛选出具有长中胚轴特性的种质资源。同时，结合全基因组选择技术，可以更加精准地筛选出具有优良性状的水稻种质资源。此外，通过应用kasp技术进行分子标记辅助选择(mas)，可以在育种过程中更加精准地选择具有优良性状的个体，从而提高育种效率和选育品质。同时，kasp技术还可以应用于水稻杂种优势的预测和鉴定，为水稻育种提供更加全面的技术支持。

5、水稻旱直播技术是一种先进的农业技术，其在水稻种植过程中可以大大节省人力成本，并且有利于大规模机械化作业。然而，旱直播技术在水稻出苗率低、出苗不齐以及杂草难控等问题上仍存在一些挑战。为了解决这些问题，发掘中胚轴伸长相关基因并筛选和创制长中胚轴种质成为了重要的研究方向。

6、中胚轴是水稻幼苗顶土出苗过程中的重要器官，其快速伸长有助于提高水稻幼苗的出苗速率和整齐度。长中胚轴的幼苗具有对杂草的竞争优势，可有效抑制杂草的生长。但是，中胚轴是由多个微效基因控制的复杂数量性状，品种间中胚轴长度差异较大。因此，发掘中胚轴伸长基因并开发可用的kasp分子标记是长中胚轴育种亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种鉴定水稻中胚轴长度的分子标记及其与应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供一种鉴定水稻中胚轴长度的分子标记，所述分子标记为水稻3号染色体上如序列表中seq id no.1序列所示的第37位的核苷酸，其核苷酸种类为c或t。

4、本发明通过提供一种适用于分子标记辅助育种的分子标记，通过全基因组关联分析找到与中胚轴长度相关位点，该位点的名称为kasp-3-31.8，该标记是一个能用于鉴定水稻中胚轴长度的snp位点，与目标性状紧密连锁。在选择中胚轴较长的水稻时，可以利用该分子标记kasp-3-31.8，减少传统育种技术中表型选择的繁琐和误差，来提高选择的准确性和效率。利用该位点进行分析，中胚轴长度和水稻基因型的长度关联分析，p值小于0.05，说明该分子标记来区分中胚轴长度，在统计学上具有显著性。

5、第二方面，本发明提供一种鉴定水稻中胚轴长度的分子标记的应用，包括包括如下a1)-a3)的任一种：

6、a1)鉴定待测水稻中胚轴的相对长度；

7、a2)筛选具有长中胚轴的水稻品种；

8、a3)水稻育种。

9、本发明的分子标记kasp-3-31.8可以快速、准确地检测出待测水稻中胚轴的相对长度，为育种过程中的选择提供依据，通过利用本发明的分子标记，可以从大量的水稻品种中筛选出具有长中胚轴的优良品种，提高育种效率。在水稻育种过程中进行基因型的选择和组合，实现高效、精准的育种。

10、作为本发明应用的优选实施方式，上述应用适用水稻亚种为籼稻亚种。籼稻是栽培稻的一个亚种，是中国传统水稻品种之一。籼稻的米粒外形细长，口感柔软，适合用来制作米饭和粥。在中国，籼稻的种植面积约占水稻总面积的60％以上，主要分布于华南热带和淮河以南的亚热带低地。本发明通过该分子标记，能够鉴定与目前特征性的短中胚轴籼稻材料ir 145或长中胚轴材料irgc 135929的性状相吻合的籼稻品种，该位点能够有效的进行群体基因分型。

11、第三方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度的方法，包括以下步骤：检测待测水稻基因组中如权利要求1所述的分子标记，判断分子标记的核苷酸种类为c或t，核苷酸为c的纯合型水稻为cc纯合型水稻，核苷酸为t的纯合型水稻为tt纯合型水稻，所述cc纯合型水稻的中胚轴短于tt纯合型水稻。

12、本发明通过提供鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度的方法，该方法利用水稻基因组中的分子标记进行中胚轴长度鉴定，相比传统的基因分型技术，可以快速准确地鉴定出中胚轴长度的性状，而且不影响该目标性状的表达。利用分子标记可以预测未知基因型的个体，从而在早期世代中进行选择，提高育种效率和准确性。该分子标记为一个snp位点，因此可以利用snp检测中的大规模平行测序等技术，在短时间内对大量样本进行snp检测，从而加速了水稻中胚轴长度性状的鉴定过程；分子标记/snp检测通常采用基于聚合酶链式反应(pcr)的技术，可以检测到单个碱基的差异，具有非常高的灵敏度。这使得即使在dna样本中含量非常低的snp位点也能够被准确地检测出来，提高了检测的准确性；snp检测通常采用双末端测序技术，可以同时获得正向和反向的测序结果，从而提高了检测的准确性。此外，snp检测还可以通过比对分析等方法，对检测结果进行校正和优化，进一步提高了检测的准确性。

13、作为本发明所述方法的优选实施方式，包括以下步骤：

14、(1)以待测水稻的基因组dna为模版，用分子标记的检测试剂进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

15、(2)检测步骤(1)所述的pcr扩增产物的荧光信号并根据荧光信号颜色判断待测水稻的基因型；或对步骤(1)所述的pcr扩增产物进行测序获得待测水稻的基因型。

16、本发明的分子标记适用kasp进行水稻品种鉴定，特别是鉴定水稻中胚轴长度，具有以下优点：一、高效性：kasp技术可以快速、准确地鉴定水稻品种，特别是对于中胚轴长度的鉴定，可以大大提高鉴定效率；二、准确性：kasp技术可以准确检测水稻基因组中的snp位点，通过分析snp位点的分布和频率，可以准确地鉴定水稻品种的中胚轴长度；三、广泛性：kasp技术适用于各种水稻品种的鉴定，无论是常规稻还是杂交稻，都可以通过kasp技术进行准确的鉴定；四、便捷性：kasp技术所需实验材料和设备相对简单，操作流程相对简便，因此使用kasp技术进行水稻品种鉴定具有很高的便捷性。

17、作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述分子标记的检测试剂包括检测分子标记的引物组；所述引物组包括上游引物f1、上游引物f2和下游引物r；所述上游引物f1的核酸序列为seq id no:2自5’端起第22至40位所示的dna片段；所述上游引物f2的核酸序列为seq id no:3自5’端起第22至40位所示的dna片段；所述下游引物r的核酸序列如seq id no:4所示。

18、本发明的引物组是适用于竞争性等位基因特异性pcr，kasp的引物组，kasp法在引物和探针设计上与常规荧光pcr不同。首先需针对snp的等位基因设计两条对应的上游引物，引物3’末端分别位于各自的snp位点上，同时引物5’端各自带有一段独特的标签序列，而下游引物则是一条常规设计共用的引物。由于kasp技术使用的是特异性引物和探针，因此能够准确地区分不同的基因型，避免了传统pcr方法中可能出现的技术误差。因此，kasp技术比普通pcr技术具有更高的准确性和特异性，更有利于水稻中胚轴长度的鉴定之中。

19、作为本发明所述方法的优选实施方式，所述引物组中的上游引物与荧光标记相连：所述上游引物f1的荧光标记为fam，所述上游引物f2的荧光标记为hex。

20、进一步地，所述上游引物f1的荧光标签序列为fam荧光标签序列，所述fam荧光标签序列如seq id no.2自5’端起第1至21位的dna片段所示；所述下游引物f1的荧光标签序列为hex荧光标签序列，所述fam荧光标签序列如seq id no.3自5’端起第1至21位的dna片段所示。

21、本发明选用的荧光标记fam和hex都是荧光染料，它们的荧光信号相对稳定，可以在pcr实验中有效地监测扩增产物；fam和hex的荧光信号波长不同，可以有效地区分不同的基因型，缩短鉴定的流程；fam和hex的灵敏度较高，可以检测低浓度的水稻dna模板，从而减少实验的背景噪音。

22、作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，根据荧光信号颜色判断待测水稻的基因型的判断原则为：

23、若pcr扩增产物基于分子标记显示蓝色荧光信号，则对应待测水稻的基因型为tt纯合型；

24、若pcr扩增产物基于分子标记显示红色荧光信号，则对应待测水稻的基因型为cc纯合型；

25、若pcr扩增产物基于分子标记显示绿色荧光信号，则对应待测水稻的基因型为tc杂合型。

26、作为本发明方法的优选实施方式，所述方法能够在水稻育种中进行应用。

27、第四方面，本发明提了一种检测水稻分子标记或基因型的产品，包括下述b1)-b3)中的任一种：

28、b1)检测水稻中胚轴长度相关的snp多态性或基因型的产品；

29、b2)鉴定或辅助鉴定中胚轴长度的产品；

30、b3)用于水稻育种的产品；

31、所述分子标记为水稻3号染色体上如序列表中seq id no.1序列所示的第37位的核苷酸，其核苷酸种类为c或t。

32、第五方面，本发明提供了一种水稻育种的方法，包括以下步骤：将cc纯合型水稻基因组中如seq id no.1序列所示的第37位的核苷酸替换为t，得到tt纯合型水稻；所述cc纯合型水稻的中胚轴短于tt纯合型水稻。

33、本发明提供一种水稻育种的方法，由于是影响水稻产量和品质的重要因素之一，与产量和品质、水稻抗倒伏性等相关联。因此，在育种过程中，通过上述基因型的选育，能够选育出较长的中胚轴的水稻品种，有利于增加穗粒数和粒重，从而提高水稻的产量。另外，水稻中胚轴长度与植株的抗倒伏性密切相关。中胚轴过长的水稻植株容易在生长后期出现倒伏现象，影响产量和品质。因此，在育种过程中需要选择适当的中胚轴长度，以提高植株的抗倒伏性。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

35、1.本发明提供了一个分子标记及相应引物组，该分子标记能够精细定位在水稻3号染色体上(31.8mb)，该位点和水稻的中胚轴长度相关联，并且统计学上具有显著性。基于该分子标记所设计的引物组，具有高度的特异性和准确性，能够有效地针对水稻3号染色体上的特定区域进行扩增。本发明设计并合成的引物组，能应用于等位基因竞争性特异pcr法鉴定水稻中胚轴长度。这种方法利用引物组对特定基因进行扩增，通过比较不同基因型水稻的扩增产物，可以精确地鉴定出水稻的中胚轴长度。

36、2.本发明提供了的鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴的方法，能够有效鉴别出不同基因型对应的水稻中胚轴长度。这种方法基于等位基因竞争性特异pcr法，通过比较不同基因型水稻的扩增产物，可以精确地鉴定出水稻的中胚轴长度。其中cc纯合型的水稻品种比tt纯合型的水稻品种中胚轴长度具有显著差异，说明通过检测待测水稻基于kasp-3-31.8位点的基因型可以鉴定水稻中胚轴长度。这种方法可以为水稻育种提供重要的参考信息，帮助育种者选择具有优良中胚轴长度的水稻品种，提高育种效率和准确性；在水稻分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。