一种应用2A肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法与流程

本发明属于2a肽策略构建双功能酵母，具体是一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法。

背景技术：

1、2a肽又称“自我剪切”肽，是一种位于小核糖核酸病毒家族某些成员的两个蛋白质之间的寡肽，通常为18-22个氨基酸。2a肽通过使核糖体跳过2a元件c末端的甘氨酸（gly）和脯氨酸（pro）肽键的合成而发挥作用。基于此特征，2a肽常应用于多翻译产物的分离，即可在两个蛋白的编码区中间插入编码2a肽的dna片段，使得蛋白在翻译完成后发生自剪切，分成两个独立折叠的蛋白。这种方法可以避免使用传统的蛋白质分离方法，如柱层析、电泳等，从而避免了对蛋白质的损伤和污染。但2a肽的自我剪切效率会受上下游开放阅读框序列的影响，因此，不能进行有效自我剪切的融合蛋白将会是另一种翻译产物。

2、酵母表面展示系统是一种可以将外源蛋白展示在酵母表面的真核细胞表达系统。在此系统中，目的蛋白的基因序列与特定的载体基因序列融合后可通过化学转化等方法导入酵母细胞中。目的蛋白可在特定的培养基诱导下生成，并可通过酵母细胞内蛋白转运机制转移至细胞表面并且固定在细胞壁上。与噬菌体表面展示不同,酵母表面展示系统中酵母细胞具有功能更加完善的分子伴侣系统，可以辅助蛋白的折叠与修饰，从而对蛋白质的结构和功能产生影响。此外，与噬菌体不同，酵母细胞是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行分选，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离与筛选成为可能。除筛选和改造功能性多肽以外，酵母表面展示技术也可用于生物吸附、生物发酵、生物合成等方面。但是传统的酵母展示技术只能将目的蛋白展示于细胞表面，无法同时将目的蛋白分泌至培养基的上清液中，后续的目的蛋白提取、纯化等步骤不仅增加了全长目的蛋白获取的难度，还增加了实验的成本与周期。因此，构建一种既可使目的蛋白展示在细胞表面，又可使目的蛋白分泌至培养基上清液中的双功能酵母展示与分泌系统具有一定的现实应用价值。

技术实现思路

1、本发明旨在解决传统酵母展示系统中目的蛋白只能展示在细胞表面，不能同时分泌至培养基上清液中的问题。为此，本发明提出了一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法。

2、一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，该方法具体包括如下步骤：

3、以绿色荧光蛋白为目的蛋白，将来源于口蹄疫病毒的2a肽序列插入pyd1质粒的aga2表达盒中并与下游目的基因gfp的序列相连，构建重组质粒pyd1-f2a-gfp；

4、将重组质粒转化至酵母菌株eby100中，并通过阳性克隆筛选、目的蛋白诱导表达、提取与鉴定步骤，利用2a肽自我剪切但不能每次均有效剪切的特性，构建出一种同时具有蛋白分泌及表面展示双功能的新型酵母展示系统。

5、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

6、本申请通过提供的方式，解决了传统的酵母展示系统中目的蛋白只能展示在细胞表面，不能同时分泌至培养基上清液中这一问题。

技术特征：

1.一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，目的片段包括flag标签序列、口蹄疫病毒的2a肽序列及gfp序列。

4.根据权利要求1所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，重组质粒化转至酿酒酵母具体方式为：

5.根据权利要求1所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，阳性克隆筛选及提取具体方式为：

6.根据权利要求1所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，目的蛋白诱导表达具体方式为：

7.根据权利要求1所述的一种应用2a肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，其特征在于，目的蛋白westernblot鉴定：

技术总结
本发明公开了一种应用2A肽策略构建双功能酵母展示与分泌系统的方法，涉及2A肽策略构建双功能酵母技术领域，通过以绿色荧光蛋白为目的蛋白，将来源于口蹄疫病毒的2A肽序列插入pYD1质粒的Aga2表达盒中并与下游目的基因GFP的序列相连，构建重组质粒pYD1‑F2A‑GFP；将重组质粒转化至酵母菌株EBY100中，并通过阳性克隆筛选、目的蛋白诱导表达、提取与鉴定步骤，解决了传统的酵母展示系统中目的蛋白只能展示在细胞表面，不能同时分泌至培养基上清液中这一问题。

技术研发人员：柳曹枝,陈雅琦
受保护的技术使用者：南京瑞源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6