一种多酶协同制备还原糖的方法

本发明涉及多糖制备工艺，确切地说是一种多酶协同制备多种还原糖的方法。

背景技术：

1、作物秸秆的主要成分—木质纤维素中所含丰富的多糖类物质为生物能源的生产提供了大量发酵底物，被认为是用于生产液体燃料和化学品最有前景的化石资源替代原料。基于酶的木质纤维素的生物转化具有更高的特异性，更低的能量摄入，温和的操作条件、更高的产量等优势。

2、木葡聚糖大约占植物初生细胞壁干重的25％，是植物初生细胞壁的主要结构性多糖，也是一种高度支化的杂多糖。其主链(葡萄糖)与侧链(木糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖)分子间的交联形成了难以被酶解的复杂的网络化底物结构，需要多种水解酶协同作用于木葡聚糖的主链和侧链才可以实现有效的酶解。因此，建立木质纤维素高效水解糖化途径，可以促进生物质能源的高效利用。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种从bifidobacterium asteroides(星状双歧杆菌)w8111中挖掘到可以降解木葡聚糖的多糖利用位点baxygul，对其中的每个单酶进行重组克隆、基因工程菌构建及酶的表达纯化等制备方法，以及公开该多糖利用位点协同将木葡聚糖降解为葡萄糖、木糖和半乳糖的制备方法，即多酶协同制备还原糖的方法。所述的还原糖指的是葡萄糖、木糖和半乳糖中的一种或多种。

2、上述目的通过以下方案实现：

3、一种天然组合多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于，包括以下方法：

4、(1)bifidobacterium asteroides w8111序列分析

5、通过分析获得来自于bifidobacterium asteroides w8111的一段可降解木葡聚糖的多糖利用位点baxygul；

6、分析方法为全基因组测序研究法；

7、(2)分子克隆与构建重组质粒

8、参考b.asteroidesw8111基因序列设计特异性引物，以提取的b.asteroidesw8111基因组作为模板对目的基因进行pcr扩增，获得了全部的目的基因，经过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后根据引物所带有的位点选择特异性限制性内切酶进行酶切与连接，构建重组质粒；

9、(3)蛋白的表达与纯化

10、重组质粒转化至e.colitrans1-t1感受态细胞中，涂布在带有kana抗性的平板中进行克隆子筛选，挑取单菌落转移至10-12ml带有kana抗性的lb液体培养基中扩大培养并提取质粒进行测序验证，验证正确的质粒转化至e.coli t7 express中扩大培养，经过亲和层析、阴离子交换柱层析、分子筛层析纯化之后获得了高纯度的目的蛋白，即得到经过纯化的来自多糖利用位点baxygul中的九种酶；

11、(4)天然木质纤维素原料制备还原糖

12、以经蒸汽爆破的玉米秸秆或玉米芯或二者的混合物为底物，底物的浓度1-2g/l，加入步骤(3)经过纯化的来自多糖利用位点baxygul中的最优5种酶组合，在35-36℃、ph6.8-7.0的条件下反应22-24h，反应结束后加入等体积的dns溶液，于95-100℃下反应10-12min，即得。

13、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：

14、步骤(2)包括以下步骤：

15、a、厌氧培养bifidobacterium asteroides w8111

16、使用改良的mrs培养基，在改良mrs固体平板划线培养bifidobacteriumasteroides w8111，在35-36℃厌氧培养箱中静置培养70-72h；

17、b、分子克隆

18、使用细菌基因组dna提取试剂盒提取bifidobacterium asteroides w8111的基因组，以提取得到的基因组为模板，设计特异性引物对目的基因进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳用于分析与分离目的基因片段，琼脂糖凝胶试剂盒对目的基因片段进行纯化回收；

19、c、构建重组质粒

20、根据引物中设计的酶切位点，对回收后的目的基因进行双酶切，并对应的切割pet28a(+)质粒，得到双酶切后的dna基因；

21、双酶切后的dna基因使用dna纯化试剂盒对产物进行回收，dna连接酶将目的片段与经过相同酶切割的载体片段进行连接，baaxe使用无缝克隆的方法，使用assembly mix连接回收后的目的片段与经过双酶切的pet28a(+)，连接后的产物转化至trans1-t1感受态细胞中，37-38℃条件下使用带有kana抗性的lb固体培养基进行筛选培养，挑取单菌落进行通用引物菌落pcr，琼脂糖凝胶试剂盒筛选阳性克隆子，将阳性菌落接种至kana抗性的10-11ml lb液体培养基中过夜培养，质粒小提试剂盒提取重组质粒并进行测序分析，即可。

22、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：

23、步骤(3)所述的蛋白表达与纯化步骤如下：

24、取1-1.5μl经过测序验证的的来自于bifidobacteriumasteroides w8111的一段可降解木葡聚糖的多糖利用位点baxygul的争取载体转化至e.coli t7 express感受态细胞中，涂抹至带有kana抗性的lb平板上，于37-38℃培养箱中静置过夜，挑取明显的单菌落转入5-6ml带有kana抗性的lb液体培养基中，在37-38℃、200-210rpm摇床中震荡培养12-13h，在从其中取100-110μl转接入10-12ml带有kana抗性的lb液体培养基中，继续在相同条件下培养4-6h,扩大培养，通过将活化的10-12ml液体培养基转接入1-1.2l的带有kana抗性的液体培养基中,在37-38℃、200-210rpm摇床中震荡培养3-5h,降低培养温度至15-16℃，之后加入iptg诱导，iptg终浓度为0.2-0.25mm,经过200-210rpm过夜震荡于37-38℃下过夜培养12-14h培养后，在2650-2700g离心力，4-5℃条件下离心10-15min，除去上清液，收集菌体沉淀，使用lysis buffer将菌体重悬，每升菌液加入30-35ml lysis buffer，之后依次加入dnase i溶液、lysozyme溶液、mgcl2溶液以及pmsf溶液用于溶菌，在4-5℃下慢速搅拌1-1.2h，利用4-5℃预冷的高压均质机均质，以此对菌体进行破碎，收集到的悬浊液再次在4-5℃、11000-12000g离心力条件下离心1-1.2h，收集上清并置于4-5℃环境中，保证蛋白性质，分别经ni-nta亲和柱层析、source 15q阴离子交换柱层析、凝胶过滤层析后，将纯化后的蛋白进行分装，利用液氮速冻后，存于-80到-75℃冰箱中，得到经过纯化的来自多糖利用位baxygul中的九种酶。

25、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：

26、步骤a的厌氧培养箱中含有5-6％h2，5-6％co2，88-90％n2；

27、步骤b中使用细菌基因组dna提取试剂盒dp302提取bifidobacteriumasteroidesw8111的基因组，以提取得到的基因组为模板，设计特异性引物对目的基因进行pcr扩增；

28、步骤b中的琼脂糖凝胶试剂盒型号为dp219-02。

29、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：

30、步骤(3)中每升菌液加入30-35ml lysis buffer，之后依次加入30μl 1mg/ml的dnase i溶液、100μl 50mg/ml的lysozyme溶液、75μl的4m mgcl2溶液以及100μl pmsf溶液用于溶菌，30μl 1mg/ml的dnase i溶液、100μl 50mg/ml的lysozyme溶液、75μl的4m mgcl2溶液以及100μl pmsf溶液用于溶菌。

31、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：步骤(3)中使用高压均质机在10000-12000bar条件下均质5-10min。

32、所述的一种多酶协同制备还原糖的方法，其特征在于：步骤a中所述的改良的mrs培养基的制备方法为：

33、取蛋白胨10-12g/l，牛肉膏10-12g/l，酵母粉5-6g/l，k2hpo42-3g/l，柠檬酸二铵2-3g/l，乙酸钠5-6g/l，葡萄糖20-22g/l，吐温80 1-1.2ml，七水硫酸镁0.58-0.6g/l，四水硫酸锰0.25-0.3g/l，琼脂15-16g/l，用蒸馏水配置成900-1000ml，121-122℃灭菌15-18min后倒平板；另配置5-6g/l半胱氨酸100-110ml，使用0.22-0.3μm无菌滤膜滤过除菌，待平板冷却至50-55℃后于超净台中加入无菌半胱氨酸混匀倒平板，即得。

34、以2g/l罗望子木葡聚糖为底物的多酶水解组合实验

35、测定多酶组合对木葡聚糖是否含有协同降解的作用，使用商业化的终浓度为2g/l罗望子木葡聚糖作为底物，每种酶蛋白的浓度均为1mm，在35℃、ph 7.0的条件下反应24h，使用dns测定水解产物的还原糖含量。反应结束后加入等体积的dns溶液，于100℃下反应10min。于540nm波长下测定吸光度，以确定还原糖产量，以同等体积的superdex buffer代替蛋白液作为对照。最终确定最优酶组合酶解底物的还原糖产量。

36、本发明的有益效果为：

37、(1)通过全基因组测序研究发现蜜蜂肠道bifidobacteriumasteroides w8111中含有降解木葡聚糖的一个单一且复杂的多糖利用位点，这也是目前发现的唯一一个来源于bifidobacterium的降解木葡聚糖的多糖利用位点(baxygul)

38、(2)baxyguls是由高特异性的活性酶和识别蛋白、转运蛋白集合在基因组中形成一个基因簇，其各个位点被严格调控，具有更高效的协同降解能力，如图1所示。

39、(3)通过明确baxygul中的九个潜在cazymes基因序列信息、体外纯化、及酶解木葡聚糖实验，获得最高效协同的5种酶组成的最简多糖利用位点，并确定了包括内切木葡聚糖酶bagh5、β-半乳糖苷酶bagh42、α-木糖苷酶bagh31、β-葡萄糖苷酶bagh1以及纤维二糖磷酸化酶bagt。

40、(4)baxygul中具有高效协同作用的5种水解酶，就可以降解木葡聚糖产生葡萄糖、木糖和半乳糖(如图2)。首先由bagh5对木葡聚糖主链进行切割产生木葡聚糖寡糖，而后bagh42与bagh31可以在寡糖的基础上对侧链的半乳糖与木糖进行切割，暴露出主链的葡萄糖由bagh1与bagt进行水解与磷酸解，最终分解成单糖。

41、(5)baxygul的酶基因编号、序列长度、ncbi注释信息被归纳在表1。baxygul包括九种酶，分别是：baaxe乙酰酯酶，bagh27岩藻糖苷酶、bagh31木糖苷酶、bagh5内切木葡聚糖酶、bagh43阿拉伯呋喃糖苷酶、bagh42半乳糖苷酶、baab酯酶、bagt纤维二糖磷酸化酶、bagh1葡萄糖苷酶。与其他来源的降解木葡聚糖的多糖利用位点比较发现，baxygul所包含的酶在家族来源方面与其他来源的降解木葡聚糖的多糖利用位点的序列存在较大差异。