用于检测TERT基因启动子区C228T突变的引物、试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及分子生物学基因检测，尤其涉及一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、tert基因是编码端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，tert)的重要基因之一，端粒酶在正常体细胞中受到严格调控，最重要的限速酶是tert，正常细胞系中无tert表达，而大多数肿瘤细胞通过异常上调tert表达来维持端粒长度。自2002年以来，tert基因突变已被证实广泛分布于肿瘤中，诸如甲状腺癌、黑色素瘤、结肠癌和非小细胞肺癌等。常见的tert基因突变发生在启动子区域，tert启动子区突变将会上调tert mrna和蛋白表达以及端粒长度，甲状腺癌中tert突变常见于启动子区的c228t和c250t位点。因此，tert基因启动子区c228t位点的检测对癌症的诊断、预后和预测具有重要作用。

2、在临床实践中，tert突变主要是基于dna的分析，并利用聚合酶链式反应(英文简称：pcr)进行检测。但是tert基因在启动子区域的突变具有突变丰度低，检测区域内gc碱基含量高的特点，这些特点增加了tert启动子区域基因突变的检测难度。现有的检测方法有一代测序(一代测序即sanger测序)、等位基因特异性扩增(英文简称：arms-pcr)和高分辨率溶解曲线分析(英文简称：hrm)。其中hrm是根据dna序列的物理性质，应用高分辨率溶解曲线对样本进行分析，灵敏度可达到1％，但由于对核酸序列的gc碱基含量和tm值差异有较高要求，反应孔间0.1℃的差异就无法保证分析准确性，因此其对于检测仪器的要求非常高，常规的检验室无法满足该技术要求；arms-pcr通常设计有两对上游引物，分别与突变dna和正常dna互补，扩增时只有与突变dna序列完全互补的引物才能延伸复制，并通过与其结合探针的荧光信号值进行检测，该方法的检测灵敏度可达到1％，但因其方法学的限制，只能检测已知突变，且受限于聚合酶的保真性，引物在碱基错配的情况下仍可以延伸扩增，易产生假阳性结果。sanger测序是tert突变检测的金标准，相比其他两种方法能以较低的成本分析未知dna序列，但是其检测灵敏度只有约20％，对于突变含量较低的样本难以有效检测。

3、因此，有必要开发一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法以解决现有技术存在的上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测tert基因启动子区c228t突变的引物、试剂盒及使用方法，以解决sanger测序中对于gc碱基含量高、突变含量低的样本难以有效检测的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种引物，所述引物用于检测tert基因启动子区c228t突变，所述引物包括第二上游引物和第三上游引物，所述第二上游引物用于扩增野生型和突变型dna模板，所述第三上游引物用于抑制野生型dna模板扩增。

3、可选的，所述第三上游引物由通用模板重叠序列、突变型模板匹配区序列、gc保守区域和阻遏序列依次连接组成。

4、可选的，所述引物还包括第一上游引物，所述第一上游引物的序列如seq id no.1所示，所述第二上游引物的序列如seq id no.2所示，所述第三上游引物的序列如seq idno.3所示。

5、可选的，所述引物还包括第一下游引物和第二下游引物，所述第一下游引物的序列如seq id no.4所示，所述第二下游引物的序列如seq id no.5所示。

6、可选的，所述第一上游引物与模板序列完全匹配，所述第二上游引物与模板序列完全匹配，所述第一下游引物与模板序列完全匹配，所述第二下游引物与模板序列完全匹配。

7、第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述引物，所述试剂盒用于检测tert基因启动子区c228t突变。

8、可选的，所述试剂盒还包括第一缓冲液和第二缓冲液，所述第一缓冲液包括序列如seq id no.1所示的第一上游引物和序列如seq id no.4所示的第一下游引物，所述第二缓冲液包括序列如seq id no.2所示的第二上游引物、序列如seq id no.3所示的第三上游引物和序列如seq id no.5所示的第二下游引物。

9、可选的，所述第一上游引物在所述第一缓冲液中的浓度为0.02μm～2μm，所述第一下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.02μm～2μm。

10、可选的，所述第二上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μm～2μm，所述第三上游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.4μm～4μm，所述第二下游引物在所述第二缓冲液中的浓度为0.2μm～2μm。

11、可选的，所述试剂盒还包括第一酶混合液、第二酶混合液、测序引物和阳性质控品。

12、可选的，所述阳性质控品包括tert基因启动子区c228t纯合突变的gdna标准品，所述gdna标准品在所述阳性质控品中的浓度为5ng/μl-20ng/μl。

13、第三方面，本发明提供了一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

14、s0：获取基因组dna，并将所述基因组dna作为模板，提供第一缓冲液、第一酶混合液、第二缓冲液、第二酶混合液和测序引物；

15、s1：将所述第一缓冲液、所述第一酶混合液和所述基因组dna混匀进行第一次pcr扩增以得到第一轮pcr产物；

16、s2：将所述第二缓冲液、所述第二酶混合液和所述第一轮pcr产物混匀进行第二次pcr扩增以得到第二轮pcr产物；

17、s3：对所述第二轮pcr产物进行sanger测序。

18、可选的，步骤s3中，对所述第二轮pcr产物进行sanger测序具体包括以下步骤：对所述第二轮pcr产物进行sanger测序以得到测序峰图，通过所述测序峰图识别tert基因启动子区c228t的突变情况，当所述测序峰图的计算检测位点的信号比≥10％时，阳性检测结果为有效。

19、本发明的有益效果在于：

20、1.第二上游引物和第三上游引物发生协同作用，第二上游引物用于扩增野生型和突变型dna模板，第三上游引物用于抑制野生型dna模板扩增，从而使得突变型dna模板在总扩增dna模板中的占比提高，具体为：第二上游引物和第三下游引物能够使得第二次pcr扩增过程中竞争性抑制野生型dna模板的扩增，从而显著提高突变型dna序列占总扩增dna模板的比例。使得sanger测序对突变位点的检测灵敏度从20％提高至1％，且保持较高的准确率和特异性。

21、2.第三上游引物中的gc保守区域的选择和设计可降低第二次pcr扩增过程中的tm值，从而在增加dna模板扩增效率的基础上，最大程度降低非特异性扩增的发生，保证检测结果的特异性。

22、3.引物均没有进行额外的化学修饰、生物素或荧光基团标记，使得引物的成本低廉，可以应用于临床大范围检测tert基因启动子区c228t突变。

23、4.试剂盒通过两次pcr扩增，在富集靶向序列的基础上，采用引物组序列对dna模板进行扩增，扩增稳定性好，避免了dna模板的启动子区域扩增容易失败的问题。