本公开涉及非病毒dna载体，其包括编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体可用于在需要其治疗的受试者中治疗低磷酸酯酶症(hypophosphatasia)或治疗、缓解或预防低磷酸酯酶症的一种或多种症状。
背景技术：
1、基因疗法是医学中的一种创新方法，旨在通过向患者的细胞中递送新的遗传物质以补偿或阻抑突变基因的功能和/或治疗遗传病症来治疗遗传性和获得性疾病。
2、基因疗法中使用的载体分为两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒基因疗法载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒。(lundstrom k.viralvectors in gene therapy.diseases.2018年5月21日；6(2))。病毒载体可以主动进入宿主细胞并高效地转染。病毒载体的主要优点是由于病毒的天然性质而快速高效地向细胞递送治疗性遗传物质。然而，考虑到炎症、对基因疗法的免疫反应、细胞毒性、诱变和癌变的风险，病毒载体在临床实践中的应用相当有限。仍然需要用于治疗性基因递送的非病毒载体。
技术实现思路
1、本公开涉及环状非病毒dna载体；包括所公开的环状非病毒dna载体中的一种或多种的组合物；以及在哺乳动物(例如，人类患者)中从所公开的环状非病毒dna递送和/或表达一种或多种治疗性基因的方法。本文公开的环状非病毒dna载体能够促进由载体递送到细胞的转基因的持续表达。
2、本公开的第一方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其包含：包含表达盒的第一部分，所述表达盒包括编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列，其中所述编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列中的每一个可操作地连接到启动子；以及能够形成至少一个十字形结构的第二部分。在一些实施方案中，所述第二部分包含至少两个反向重复序列。在一些实施方案中，所述至少两个反向重复序列由具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列分隔。
3、在一些实施方案中，非病毒dna载体基本上没有cpg序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约750个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约700个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约600个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约500个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约400个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约300个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约200个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约150个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约50个cpg/载体。
4、在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少5个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少10个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少15个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少20个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少25个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列具有至少3个核苷酸并编码细菌复制起点的至少一部分。在一些实施方案中，复制起点包括源自pmb1、pbr322、cole1、p15a、psc101或f1的序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码异源基因或异源基因的一部分。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌阻抑因子trna。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌rnai阻遏物。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码反义rna。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌操纵子序列或其一部分。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含lac操纵子。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含tet操纵子。
5、在一些实施方案中，非病毒dna载体缺乏耐药基因。在一些实施方案中，非病毒dna载体包括一个或多个重组位点。在一些实施方案中，所述一个或多个重组位点选自loxp位点、frt位点、attb和attp位点或其产物位点attl或attr，或源自这些位点的替代重组靶位点，例如，lox511或lox66位点。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上双链的。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上超螺旋的。
6、在一些实施方案中，基本上超螺旋的非病毒dna载体包含一个或多个负超螺旋区域。在一些实施方案中，非病毒dna载体是非免疫原性的。
7、在一些实施方案中，每个反向重复序列源自一种或多种aav血清型内存在的核酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少91％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少92％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id n0：1-18中的任一个具有至少94％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seqid no：1-18中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含seq id no：1-18中的任一个。
8、在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件，但包含细菌复制起点的至少一部分。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件，但包含细菌复制起点的至少一部分作为所述第二部分的一部分。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件，但包含细菌复制起点的至少一部分，但不在所述第二部分内。
9、在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少91％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少92％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少94％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列具有具有seq id no：58-59中的任一个的核苷酸序列。
10、在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少90％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少90％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少90％同一性的第三核酸序列。前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少92％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少92％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少92％同一性的第三核酸序列。
11、前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少95％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少95％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少95％同一性的第三核酸序列。前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少96％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少96％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少96％同一性的第三核酸序列。前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少97％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少97％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少97％同一性的第三核酸序列。前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少98％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少98％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少98％同一性的第三核酸序列。前述权利要求中任一项的分离的环状非病毒dna载体，其中所述第二部分包含与seq idno：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少99％同一性的第一核酸序列；与seq idno：58-59中的任一个具有至少99％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少99％同一性的第三核酸序列。
12、在一些实施方案中，所述第二部分包含具有seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个的第一核酸序列；具有seq id no：58-59中的任一个的第二核酸序列；以及具有seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个的第三核酸序列。
13、在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq idno：35和60中的任一个具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含具有seq id no：35和60中的任一个的核酸序列。
14、在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质选自alpl、pcsk9、pcsk7、serpina1、abcb4(与seq id no：64、65、66或69中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、atp7b(与seq id no：70或83中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、alat(与seqid no：66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、abcb11、抗cd19-抗cd3(与seq id no：67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、bdf8(与seq id no：68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)及其变体。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质为碱性磷酸酶或其变体。
15、本公开的第二方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其包含：包含表达盒的第一部分，所述表达盒包括编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列，其中所述编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列中的每一个可操作地连接到启动子；以及能够形成至少一个十字形结构的第二部分，其中所述第二部分具有式x-y-x′，其中x和x′各自为反向重复序列，并且其中y不是重复的并包含具有至少3个核苷酸的核苷酸序列。
16、在一些实施方案中，非病毒dna载体基本上没有cpg序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约400个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约300个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约200个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约150个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约50个cpg/载体。
17、在一些实施方案中，y包含至少5个核苷酸。在一些实施方案中，y包含至少10个核苷酸。在一些实施方案中，y包含至少15个核苷酸。在一些实施方案中，y包含至少20个核苷酸。在一些实施方案中，y编码细菌复制起点的至少一部分。在一些实施方案中，y编码异源基因或异源基因的一部分。在一些实施方案中，y编码细菌阻抑因子trna。在一些实施方案中，y编码细菌rnai阻遏物。在一些实施方案中，y编码反义rna。在一些实施方案中，y编码细菌操纵子序列。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含lac操纵子。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含tet操纵子。
18、在一些实施方案中，非病毒dna载体缺乏耐药基因。在一些实施方案中，非病毒dna载体包括一个或多个重组位点。在一些实施方案中，所述一个或多个重组位点选自loxp位点、frt位点、attb和attp位点或其产物位点attl或attr，或源自这些位点的替代重组靶位点，例如，lox511或lox66位点。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上双链的。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上超螺旋的。在一些实施方案中，基本上超螺旋的非病毒dna载体包含一个或多个负超螺旋区域。在一些实施方案中，非病毒dna载体是非免疫原性的。
19、在一些实施方案中，x和x′源自一种或多种aav血清型内存在的核酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少91％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少92％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少94％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，x和x′各自包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件，但包含细菌复制起点的至少一部分。
20、在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少91％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少92％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少94％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y具有与seq idno：58-59中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，y的核苷酸序列具有seq id no：58-59中的任一个。在一些实施方案中，y不包括细菌复制起点或其任何部分。
21、在一些实施方案中，非病毒dna载体包括细菌复制起点或细菌复制起点的部分，但其中所述细菌复制起点或所述细菌复制起点的部分不包括在所述第二部分中。在一些实施方案中，非病毒dna载体包括细菌复制起点或细菌复制起点的部分，但其中所述细菌复制起点或所述细菌复制起点的部分不包括在y中。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质选自alpl、pcsk9、pcsk7、serpina1、abcb4(与seq id no：64或65中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、atp7b(与seq id no：70或83中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、alat(与seq id no：66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、abcb11、抗cd19-抗cd3(与seq id no：67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、bdf8(与seq id no：68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)及其变体。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质为碱性磷酸酶或其变体。
22、本公开的第三方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其包含以5′至3′方向可操作地连接的以下元件：(i)第一重复序列；(ii)具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列；(iii)第二重复序列；以及(iv)表达盒。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约400个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约300个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约250个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约200个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约150个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约100个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约50个cpg/载体。在一些实施方案中，表达盒包括编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列，其中所述编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列中的每一个可操作地连接到启动子。
23、在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少5个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少10个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少15个核苷酸。在一些实施方案中，非重复核苷酸序列包含至少20个核苷酸。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌复制起点的至少一部分。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码异源基因或异源基因的一部分。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌阻抑因子(suppressor)trna。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌阻抑因子rnai阻遏物。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码反义rna。在一些实施方案中，具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列编码细菌操纵子序列。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含lac操纵子。在一些实施方案中，细菌操纵子序列包含tet操纵子。
24、在一些实施方案中，非病毒dna载体缺乏耐药基因。在一些实施方案中，非病毒dna载体包括一个或多个重组位点。在一些实施方案中，所述一个或多个重组位点选自loxp位点、frt位点、attb和attp位点或其产物位点attl或attr，或源自这些位点的替代重组靶位点，例如，lox511或lox66位点。在一些实施方案中，非病毒dna载体是非免疫原性的。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上双链的。
25、在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质选自alpl、pcsk9、pcsk7、serpina1、abcb4(与seq id no：64、65、66或69中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、atp7b(与seq id no：70或83中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、alat(与seqid no：66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、abcb11、抗cd19-抗cd3(与seq id no：67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、bdf8(与seq id no：68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)及它们的变体。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质为碱性磷酸酶或其变体。
26、本公开的第四方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其包含：包含表达盒的第一部分，所述表达盒包括编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列，其中所述编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列中的每一个可操作地连接到启动子；以及能够形成至少一个十字形结构的第二部分，其中所述第二部分包含至少两个反向重复序列，并且其中所述至少两个反向重复序列由细菌复制起点的至少一部分分隔。
27、在一些实施方案中，非病毒dna载体基本上没有cpg序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约400个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约300个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约250个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约200个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约150个cpg/载体。在一些实施方案中，非病毒dna载体包含少于约50个cpg/载体。
28、在一些实施方案中，非病毒dna载体缺乏耐药基因。在一些实施方案中，非病毒dna载体包括一个或多个重组位点。在一些实施方案中，所述一个或多个重组位点选自loxp位点、frt位点、attb和attp位点或其产物位点attl或attr，或源自这些位点的替代重组靶位点，例如，lox511或lox66位点。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上双链的。在一些实施方案中，非病毒dna载体是基本上超螺旋的。
29、在一些实施方案中，基本上超螺旋的非病毒dna载体包含一个或多个负超螺旋区域。在一些实施方案中，非病毒dna载体是非免疫原性的。
30、在一些实施方案中，每个反向重复序列源自一种或多种aav血清型内存在的核酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少91％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少92％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少93％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少94％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seqid no：1-18中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个反向重复序列包含与seq id no：1-18中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件。在一些实施方案中，非病毒dna载体不包含dd元件，但包含细菌复制起点的至少一部分。
31、在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seqid no：58-59中的任一个具有至少96％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少97％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细菌复制起点的至少一部分具有与seq id no：58-59中的任一个具有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，细菌复制起点的至少一部分的核苷酸序列具有seq id no：58-59中的任一个。
32、在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少85％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少85％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少85％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少90％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少90％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少90％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少95％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少95％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少95％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少96％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少96％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少96％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少97％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少97％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少97％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少98％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少98％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少98％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少99％同一性的第一核酸序列；与seq id no：58-59中的任一个具有至少99％同一性的第二核酸序列；以及与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少99％同一性的第三核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含具有seq id n0：1、3、5、7、9、11、13、15或17中的任一个的第一核酸序列；具有seq id no：58-59中的任一个的第二核酸序列；以及具有seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一个的第三核酸序列。
33、在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
34、在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少92％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq idno：35和60中的任一个具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含与seq id no：35和60中的任一个具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二部分包含具有seq id no：35和60中的任一个的核酸序列。
35、在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质选自alpl、pcsk9、pcsk7、serpina1、abcb4(与seq id no：64、65、66或69中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、atp7b(与seq id no：70或83中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、a1at(与seqid no：66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性))、abcb11、抗cd19-抗cd3(与seq id no：67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)、bdf8(与seq id no：68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的同一性)及它们的变体。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗性蛋白质为碱性磷酸酶或其变体。
36、在一些实施方案中，非病毒dna载体还包含s/mar元件。在一些实施方案中，非病毒dna载体还包含绝缘子(insulator)元件。在一些实施方案中，表达盒还包含在所述编码一种或多种治疗性蛋白质的一个或多个核酸序列下游的聚腺苷酸化位点。
37、本公开的第五方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其包含：包含表达盒的第一部分，所述表达盒包括编码具有式(ia)至(ie)中的任一个的多肽的核酸序列，其中所述编码多肽的核酸序列可操作地连接到启动子；以及能够形成至少一个十字形结构的第二部分，其中所述第二部分包含至少两个反向重复序列，并且其中所述至少两个反向重复序列由具有至少3个核苷酸的非重复核苷酸序列分隔；
38、[a]v-[b]-[c]w-[r]q-([d]x-[e]y)z (ia)，
39、[a]-[b]-[c]-[r]q-([d]x-[e]y) (ib)，
40、([a]-[b])-([d]x-[e]y)z (ic)，
41、([a]-[b])-([e]y) (id)，及
42、[a]-[b]-[r]q-([e]y) (ie)
43、其中
44、a包含编码分泌信号肽的氨基酸序列；
45、b包含编码碱性磷酸酶的氨基酸；
46、c包含编码gpi锚的氨基酸序列；
47、r为-(mo(fc)np)-，其中m和n各自独立地包括1至6个氨基酸，其中fc为fc结构域，并且o和p各自独立地为0、1或2；
48、d包含具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或为f(g)tf，其中每个f为相同的氨基酸，g为具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t为2-5的范围内的整数；
49、e包含具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
50、q为0或1；
51、v为0或1；
52、w为0或1；
53、x为0或1至6的范围内的整数；
54、y为0或1至16的范围内的整数；并且
55、z为0或1至6的范围内的整数。
56、在一些实施方案中，当v为1、w为0、q为1、o为1、p为1、n为二氨基酸-d-i-、m为二氨基酸-l-k-、[b]包含seq id no：11、fc包含seq id no：130并且x为0时，则[e]y不包含十至十六个连续天冬氨酸残基。
57、在一些实施方案中，e包含3个氨基酸。在一些实施方案中，e为-d-s-s-。在一些实施方案中，e为-d-s-s-，并且y在1至16的范围内。在一些实施方案中，e为-d-s-s-，y为6，z为1，q为0，并且x为0。在其他实施方案中，e为-d-s s-，y为6，z为1，q为0，并且x为2。在一些实施方案中，e为-d-s-s-，y为6，z为1，x为2，并且q为1。
58、本公开的第六方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其具有与seq id no：28-30、38、40-48和72-73中的任一个具有至少80％同一性的核酸序列，例如与seq id no：28-30、38、40-48和72-73中的任一个具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna提供在药学上可接受的介质中。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种脂质纳米颗粒一起配制。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种聚合物纳米颗粒一起配制。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种蛋白脂质(proteo-1ipid)纳米颗粒一起配制。
59、本公开的第七方面为一种分离的环状非病毒dna载体，其核酸序列具有seq idno：28-30、38、40-48和72-73中的任一个。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna提供在药学上可接受的介质中。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种脂质纳米颗粒一起配制。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种聚合物纳米颗粒一起配制。在一些实施方案中，分离的环状非病毒dna与一种或多种蛋白脂质纳米颗粒一起配制。
60、本公开的第八方面为一种药物组合物，其包含前述实施方案中的任一项的分离的环状非病毒dna载体中的任一种和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物与基于脂质的递送媒介物一起配制。在一些实施方案中，药物组合物被配制成脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，药物组合物被配制成脂质纳米胶囊。在一些实施方案中，药物组合物与一种或多种聚合物一起配制。
61、本公开的第九方面为一种治疗需要其治疗的患者的方法，所述方法包括施用任何上述药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物每周施用。在一些实施方案中，药物组合物每月施用。在一些实施方案中，药物组合物每两个月施用。在一些实施方案中，药物组合物每六个月施用。在一些实施方案中，药物组合物每年施用。在一些实施方案中，药物组合物每两年施用。在一些实施方案中，药物组合物每若干年施用。
62、本公开的第十方面为一种治疗低磷酸酯酶症的方法，其包括施用治疗有效量的任何上述分离的环状非病毒dna载体或包含其的药物组合物。
63、本公开的第十一方面为一种治疗、缓解或预防低磷酸酯酶症的症状的方法，其包括施用治疗有效量的任何上述分离的环状非病毒dna载体或包含其的药物组合物。
64、本公开的第十二方面涉及任何上述分离的环状非病毒dna载体(或包含其的药物组合物)用于治疗低磷酸酯酶症的用途。