一种基于ITS序列鉴定灯台叶的方法

本发明属于药用植物分子鉴定技术，具体涉及一种利用its序列建立邻接树来快速鉴定灯台叶药材的方法及其应用。

背景技术：

1、灯台叶为夹竹桃科鸡骨常山属植物糖胶树alstonia scholaris(l.)r.br.的干燥叶，。

2、灯台叶是20世纪70年代初从云南思茅地区民间发掘出来治疗慢性气管炎的药用植物。曾以灯台树之名首载于《云南思茅中草药选》、《云南中草药选》及《云南中草药》。药用其叶，性凉，味苦，能止咳祛痰、退热消炎；用于慢性气管炎、百日咳等症，并被开发出灯台叶片等多种制剂。

3、灯台叶原植物的化学成分包括生物碱类、黄酮类、萜类、甾体类等多种活性成分，以及挥发油、维生素等，其中黄酮类有山奈酚、槲皮素、异鼠李素等，生物碱类有鸭脚树叶碱、灯台树明碱、灯台碱、鸡骨常山碱、土波台文碱等，萜类包括齐墩果酸、熊果酸等。具有抗炎镇痛、抗氧化、调节血脂血糖、调节免疫、抗肿瘤、止咳平喘、抗菌等多种药理作用。目前市场上以灯台叶为原料生产的灯台叶止咳合剂和棉榔青口服液疗效显著，备受患者认可。

4、灯台叶是云南特有的民族药，其原植物主要分布于云南南部西双版纳、思茅、河口、砚山、富宁、西畴、蒙自等地，生于海拔650m以下的丘陵山地疏林中、水沟边及村庄周围。由于灯台叶原植物含有多种药效成分，云南傣族民间历史上一直用其根、皮、叶治疗头疼、伤风、肺炎、百日咳、慢性支气管炎，其还被用于外伤止血、接骨、消肿等。近年来，云南制药企业利用灯台叶原植物的叶、树皮和枝条等作原料生产灯台叶系列药物，从而导致野生资源紧缺，制剂原料出现短缺。为满足生产需要，中国科学院西双版纳热带植物园已进行灯台叶原植物的人工栽培研究，并取得成功，将进行规模化、规范化种植。

5、傣药灯台叶为云南省的特色民族药，是“云药”产业发展的重点品种之一。目前灯台叶执行标准较低，质量控制研究较少，因此建立该药材的质量控制及评价方法是亟待解决的问题，也是保证临床疗效的关键。另外，灯台叶现代研究不能脱离傣医药基础理论指导，但目前大多数相关研究是从天然产物的角度出发，对临床的指导意义较小。因此，需以傣医药基础理论为指导，探索灯台叶的质量控制方法和治病防病的物质基础与作用机制，以此开发出更多的产品。灯台叶原植物可用于退热消炎，镇痛止咳，降血压等，树皮、根皮含有较叶更多的吲哚类生物碱，值得进一步深入研究，加以开发利用。除作药用外，灯台叶原植物还被用作城市道路和园林绿化，是一种值得深入开发利用的植物。

6、众所周知，中药材的准确鉴定对于研究中药材的质量、确保安全用药以及临床疗效至关重要。然而，当前药材市场上中药灯台叶的来源非常复杂，这就需要开发出一种有效的中药灯台叶鉴定方法。传统的鉴定方法存在不同程度的局限性，比如不同物种之间的特征性状可能会交叉重叠，种间界限模糊不清，导致分类鉴定异常困难。此外，显微鉴定和理化鉴定等方法受到鉴定人员经验、药材生长环境以及采摘方式的影响，因此其鉴定结果往往缺乏准确性和可重复性。因此，针对中药灯台叶来源复杂、传统鉴定方法存在局限的现状，急需开发一种更简便、快捷、准确、高效的中药灯台叶鉴别方法。

7、分子鉴定不同于形态鉴定，可以从物种的dna序列信息得到形态上难以得到的特异性特征，从而用以形态上难以区分鉴别的物种和品种。叶绿体基因组在被子植物中绝大多数是单亲遗传且是母系遗传，而核基因则为双亲遗传。核基因组中的its序列是核糖体dna(rdna)中的内转录间隔区(internal transcribed spacer)片段。真核生物的核糖体由核糖体rna(rrna)和核糖体蛋白构成，rrna由rdna编码。植物中18s、5.8s和25s(s为沉降系数)的rrna由45s的rdna转录单位经聚合酶i辅助转录。植物中its序列共有三段，its1、5.8s和its2(长度约为600bp)。杂交起源的物种很多保留了双亲的its序列的变异位点。叶绿体基因组中的matk基因进化速率快、易扩增也已被广泛用于植物条形码技术鉴定。本发明通过核基因组的its序列(携带两个亲本的信息)比对后构建邻接树，从而得到灯台叶的关系图。本发明可广泛用于灯台叶的鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的旨在利用本发明人收集的数据以及genbank数据库中的its序列来校准和鉴定灯台叶。提供一种利用its序列建立邻接树来快速鉴定灯台叶药材的方法及其应用。通过开发可应用于灯台叶的通用分子识别条形码，本发明为今后灯台叶药用植物的识别和分类提供更便捷的工具和方法。

2、为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

3、一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，该方法包括以下步骤：

4、步骤一：基因组dna提取；

5、步骤二：基因组浅层测序；

6、步骤三：对its序列测序结果进行过滤、组装、拼接、注释，获得its序列；

7、步骤四：网上下载鸡骨常山属的its序列；

8、步骤五：构建样品的its序列邻接树；

9、步骤六：根据邻接树判断。

10、根据所述的一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，其包括以下步骤：

11、步骤一：dna提取：取质量为5mg左右的材料放入研钵中，然后加入液氮和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)后充分研磨，使用试剂盒提取总dna，对所获得的植物基因组总dna进行检测，检测其dna浓度和纯度，以及是否降解；

12、步骤二：dna浓度和纯度合格后进行基因组浅层测序；

13、步骤三：序列过滤、组装、拼接和注释：将dna测序返回的原始序列进行过滤后组装，组装后再通过拼接、注释得到its序列；

14、步骤四：以2019年8月21日为截止日期，以待测样品所在属为单位，通过美国国家生物技术信息中心(ncbi-national center for biotechnology information)genbank数据库下载鸡骨常山属的its序列；

15、步骤五：构建样品的its序列邻接树：将注释完成的样品序列与genbank数据库下载的its序列以及我们自己包含的除待测样品外的鸡骨常山属的its序列一起比对得到矩阵，再基于p距离构建邻接树，并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率；

16、步骤六：鉴定判断：如果待测样品its序列与genbank数据库下载的灯台叶its序列聚类在一起，则说明该样品为灯台叶，否则排除该样品用作灯台叶。

17、根据所述的一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，其包括以下步骤：

18、步骤一：dna提取

19、为避免实验过程中样品被外源dna污染，dna提取选择一个未开展过分子生物学研究的密闭实验室进行，使用天根新型植物基因组dna提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，离心柱型，目录号：dp320]提取基因组dna，提取方法参照试剂盒操作手册并进行了部分修改，步骤如下：

20、1)用无水乙醇灼烧清洗干净的研钵和杵，以去除外源dna污染。

21、2)取质量为5mg左右的材料放入研钵中，加液氮和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)后充分研磨。

22、3)加入500μl缓冲液lp1和6μl rnase a(10mg/ml)，继续研磨混合，然后转移至1.5ml离心管中，涡旋振荡2min，室温放置15min。

23、4)加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，涡旋振荡2min。

24、5)12 000r/min(约13 400×g)离心5min，将上清移至新的1.5ml离心管中。

25、6)加入1.5倍体积的缓冲液lp3(例如，500μl的上清液加750μl缓冲液lp3，使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。

26、7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12 000r/min(约13 400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

27、注意：吸附柱cb3一次装载量最多为750μl。

28、8)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min(约13 400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

29、注意：如果吸附膜呈现绿色，向吸附柱cb3中加入500μl无水乙醇，12 000r/min(约13 400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

30、9)重复操作步骤8)。

31、10)将吸附柱cb3放回收集管中，12 000r/min(约13 400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

32、11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12 000r/min(约13 400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

33、12)重复操作步骤11)。离心管中收集到的溶液即提取到的总dna，于4℃短期保存，长期保存时置于-20℃条件下。

34、13)采用琼脂糖凝胶电泳检测dna片段大小，选择qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合dsdnahs(高敏感度)分析试剂盒，对dna进行精确定量。

35、步骤二：基因组浅层测序

36、①电泳检测样品有主带，需进行物理打断；②电泳检测样本显示无主带，但可见dna弥散带，且样本浓度大于0.04ng/μl的dna样本，将样本稀释至0.04ng/μl浓度后，取稀释液进行建库；③电泳检测样本显示无主带，有微弱dna弥散带或者无弥散带，且样本浓度过低，qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪无法定量的低质量dna样本，直接使用原液进行建库。步骤如下：

37、1)取25μl dna样本的稀释液或原液进行末端补平及加a尾反应，反应体系(30μl)为：dna样本25μl、ultraⅱend prep enzyme mix 1.5μl、ultraⅱend prep reactionbuffer 3.5μl；反应条件为20℃30min，65℃30min，4℃保存。

38、2)取反应产物进行接头连接反应，使用的接头为nebnext adaptor#e6609，反应体系为46.7μl。反应体系包括步骤1)产物30μl、ultraⅱligation master mix 15μl、ligation enhancer 0.5μl、0.6μmol/l nebnext adaptor 1.2μl；反应条件为20℃15min；程序执行中关闭pcr仪热盖；反应结束后立即在上述连接反应产物中加入1.5μl的usertmenzyme，混匀后置于37℃条件下15min，程序执行中pcr仪热盖温度≥50℃。

39、3)在步骤2)反应产物中添加40μl ampure xp beads进行纯化，纯化完成后，用ddh2o将纯化的dna洗脱下来。

40、4)纯化产物进行pcr扩增富集，反应体系为步骤3)纯化产物20μl、index/universal primer mix 5μl、ultraⅱq5 master mix 12.5μl；反应条件为98℃预变性30s，98℃变性10s，65℃退火/延伸75s，进行16个循环，65℃最后延伸5min，4℃保存；使用40μlampure xp beads对pcr产物进行纯化，纯化后的上清液即建好的文库。

41、5)上述文库采用agilent 2100bioanalyzer检测纯化产物的长度分布范围，利用qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合dsdna hs分析试剂盒，对文库进行精确定量。

42、6)应根据文库浓度和片段分布进行换算(从ng/μl转换为nmol/l)。文库换算公式为

43、

44、根据文库浓度和片段分布进行样品混合，在测序平台illumina xten双端测序，测序片段(reads)长度为150bp，测序数据在2gb以上。

45、步骤三：序列过滤、组装、拼接和注释：使用ngs qc toolkit v2.3对测序获得的原始数据进行过滤，去除接头和低质量序列；通过getorganelle v.1.7.5.3从过滤后的数据中组装拼接得到its序列，用geneious v.9.0.2注释its序列；

46、步骤四：以2019年8月21日为截止日期，以“alstonia internal transcribedspacer 1,5.8s ribosomal rna gene,and internal transcribed spacer 2completesequence”在genbank中搜索，并下载得到鸡骨常山属的its序列；

47、步骤五：构建样品的its序列邻接树：通过geneious v.9.0.2的mafft插件比对所有鸡骨常山属和实验样品的its序列，排除矩阵中明显错误的序列，并在geneious中进行手动矫正；将比对完成的序列，输入mega 11软件中，基于p距离模型构建邻接树，并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率；

48、步骤六：鉴定判断：如果待测样品its序列与genbank下载的灯台叶its序列聚类在一起，则说明该样品为灯台叶，否则排除该样品用作灯台叶。

49、根据所述的一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，其中所述its序列校正比对后的总长度为669bp。

50、一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，其中鉴定的灯台叶材料为标本、药材和标准药材，均不是硅胶干燥法保存的样品，且样品类型较为复杂，有根、根茎、茎秆类、皮类、叶、全草类。

51、根据所述的一种基于its序列鉴定灯台叶的方法，其中所涉及的核苷酸序列为序列表中的序列，包括鸡骨常根据所述的山属植物共24条its序列矩阵。

52、与现有技术相比，本发明在灯台叶药用植物物种鉴定和分类方面具有以下优益性：

53、本发明技术难度高，本发明首先需要进行数据收集，并整理大量的灯台叶样本数据，以建立准确的鉴定模型。其次，对复杂的its序列数据进行分析和解读，确保准确性和可靠性。最后，需要选择合适的算法和模型，以实现高效准确的物种鉴定。

54、然而，本发明的优点也是显著的。首先，通过在分子水平上准确识别灯台叶，避免了传统形态学方法可能存在的主观误判和混淆，提高了鉴定和分类的准确性。其次，采用通用分子识别条形码，为灯台叶药用植物的识别和分类提供更为便捷的工具和方法。此外，该发明还为灯台叶药用植物在临床医学和食品工业中的应用提供了有力支持。最重要的是，这些研究结果将促进灯台叶药用植物资源的可持续利用和保护，推动其产业的发展和质量控制，具有重要的科学价值和社会意义。

55、综上所述，本发明通过利用自采集的数据和genbank数据库中的its序列，开发了通用分子识别条形码，为灯台叶的鉴定和分类提供了准确、便捷的方法。其在提高灯台叶药用植物物种鉴定和分类准确性、支持临床医学和食品工业应用、促进资源可持续利用和产业发展等方面具有重要的科学和社会价值。