识别HLA-A2限制性乙肝病毒HBs346-354表位的TCR及其用途

本发明涉及细胞免疫治疗，具体涉及一种识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr及其用途。

背景技术：

1、肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)早期缺乏典型症状，临床表现隐匿，往往在疾病的晚期才被诊断，其死亡率高居癌症相关性死亡的第二位。在亚洲，至少80％的肝癌是由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)作为主要的病原性物质所引起，我国有90％肝癌患者hbsag呈阳性。在急性感染和疾病病理发生中，hbv感染可刺激机体产生一系列体液免疫和细胞免疫反应进行病毒清除；如果机体免疫反应低下，清除病毒的免疫应答不足，则hbv感染变为慢性过程。慢性感染可以触发免疫病理，导致慢性肝脏炎症和纤维化，最终导致肝硬化和/或肝细胞肝癌。

2、当前临床对hbv感染的治疗主要应用干扰素类(ifns)及核苷(酸)类药物，通过免疫调节或干扰拮抗病毒的复制。然而，这些治疗手段无法完全清除病毒，且干扰素的使用可能产生多种不良反应，核苷(酸)类药物容易出现耐药现象，导致病情反复。外科手术切除和肝移植是最有效的肝癌治疗方法，但符合这些手术标准的患者不足30％，而且供体肝脏的等待时间很长，导致将近25％的患者因肿瘤发展而不能进行肝移植操作。化疗和分子靶向治疗对肝癌患者的预后有一定作用，但五年内术后复发率仍高达80％。可见，现有的治疗手段只能抑制而非清除hbv，且患者复发率高，易产生耐药性。

3、现有研究发现在一些受试者中天然产生的hbv表位特异性t细胞对抑制病毒复制、清除病毒感染起着决定性作用。但慢性乙肝的持续感染可形成肝内免疫耐受环境，进而造成hbv特异性cd8+t细胞产生耐受或耗竭，同时导致免疫介导的炎症性肝损伤。对慢性hbv感染患者的免疫系统进行重建可使hbv感染症状消退甚至消除hbv。已有研究表明，hbv特异性cd8+t细胞对抑制病毒复制、清除病毒感染起着决定性作用。hbv特异性tcr基因修饰的t细胞(tcr-t)过继转移，已初步证明可清除乙肝病毒感染，重建hbv感染患者的免疫系统。

4、tcr是t细胞抗原受体，由α、β两条肽链组成,每条肽链又可分为可变区(v区)和恒定区(c区)，它是t细胞免疫应答中的重要组成部分，通过识别依赖组织相容性复合体(major histocompatibility complex,mhc)分子递呈的抗原肽，引起胞内细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的t细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

5、有研究表明，hbv感染时，其dna可以整合到宿主基因组中，且整合频繁发生于感染的早期阶段，这种整合不仅可以触发正常肝细胞的致癌转换，还可以导致hcc细胞中hbv抗原的表达。这些病毒蛋白质可以被加工为病毒短肽，由mhc i类分子组装到细胞表面，形成t细胞的理想靶点，且不受hbv感染受试者血清中出现的大量循环乙肝病毒表面抗原(hbsag)、或可以累积hbsag的循环单核细胞和b细胞的影响而受到抑制。

6、因此，以hbv相关蛋白(如hbsag、hbcag等)为靶点的hbv tcr-t细胞会更特异性地攻击hcc细胞，是目前治疗hcc的新的理想靶点。而如何分离筛选并鉴定得到能识别并结合特异性抗原的t细胞抗原受体(t cell receptor,tcr)，是这种免疫疗法应用需要解决的关键问题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种能识别并结合由mhc i类分子呈递的hla-a2-hbs346-354抗原复合物的反应性tcr。通过使用外源t细胞受体重定向hbv感染患者的淋巴细胞，将可识别hbv抗原的tcr基因稳定整合至患者的t细胞中，使得原本不具备抗原特异性识别能力的t细胞可识别并杀伤表达相应hbv抗原的靶细胞，建立个体化的识别hbv抗原的tcr-t细胞治疗技术，从而达到治疗肝炎和肝癌的目的。

2、具体的，所述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr包括α链可变区和β链可变区；所述α链可变区的编码基因如seq id no.1的第1-272位所示，seq id no.1中，第76-96位、第148-162位、第265-303位分别为cdr1、cdr2、cdr3三个互补决定区的编码基因；所述β链可变区的编码基因如seq id no.3的第1-282位所示，seq id no.3中，第79-93位、第145-162位、第274-303位分别为cdr1、cdr2、cdr3三个互补决定区的编码基因。

3、优选的，所述α链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，其中第26-32位、第50-54位和第89-101位分别为cdr1、cdr2、cdr3三个互补决定区的氨基酸序列；所述β链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示，其中第27-31位、第49-54位和第92-101位分别为cdr1、cdr2、cdr3三个互补决定区的氨基酸序列。

4、优选的，所述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr还包括α链恒定区和β链恒定区，所述α链恒定区序列如seq id no.5所示，所述β链恒定区序列如seq id no.6所示。

5、优选的，所述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr的筛选方法如下：

6、步骤1：靶点选择：将hbv所有肽段进行酶切后通过计算生物学模拟筛选出具有免疫原性且预测与hla-a*0201结合亲和力小于50nm的hbs346-354抗原表位；

7、步骤2：体外合成hbs346-354抗原肽；

8、步骤3：从hbv感染康复志愿者血液中分离外周血淋巴细胞(pbmc)并筛选hla分型为hla-a2的pbmc；

9、步骤4：hbs346-354抗原表位特异性t细胞的体外刺激和培养：将上述分离的pbmc与hbs346-354多肽共孵育；

10、步骤5：抗原肽特异性ctl(细胞毒性t淋巴细胞)流式筛选：将步骤4的培养物离心重悬，加入的hbs346-354四聚体(tetramer)、anti-cd8-bv421抗体，混匀孵育，利用流式细胞术分选收集cd8+、tetramer+双阳性的t细胞，即为抗原肽特异性的ctl；

11、步骤6：靶向hbs346-354抗原肽tcr测序：通过引物设计、cdna模板制备、巢式pcr扩增、电泳回收扩增产物测序实现对单个分离的抗原肽特异性ctl的测序，根据测序结果筛选出相互配对的抗原特异性ctlα链与β链；

12、步骤7：亲和力预测：计算筛选出的tcrα和β链与hla-a2-hbs346-354复合物的结合能，选择结合能小的α链与β链组别(结合能越小，亲和力越好)。

13、本发明的目的之二是提供一种慢病毒载体，为反应性hla-a2限制性乙型肝炎病毒hbs346-354特异性tcr受体载体，所述载体包括tcr的α链和β链，其编码基因序列如seq idno.7所示，其中第7-66位为sp序列，第73-405位为β链可变区序列，第415-944为β链恒定区序列，第945-1077位为furin和p2a序列，第1084-1419位为α链可变区序列，第1438-1845位为α链恒定区序列。

14、本发明的目的之三是提供一种tcr-t细胞，包含上述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr或者慢病毒载体，为通过合适的方法如电转、转染或转导、crispr/cas9基因编辑技术将所述tcr、载体引入的受体细胞，可表达特异性结合hla-a2-hbs346-354复合物的tcr。

15、本发明的目的之四是提供一种药物组合物，包括活性成分，所述活性成分为上述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr、慢病毒载体或者tcr-t细胞。

16、本发明的目的之五是提供上述识别hla-a2限制性乙肝病毒hbs346-354表位的tcr、慢病毒载体、tcr-t细胞、药物组合物在制备用于治疗由hbv感染所致的慢性乙型肝炎或肝细胞肝癌的药物中的用途。

17、本发明具有以下有益效果：

18、本发明的hbv反应性tcr识别hla-a2限制性的hbv表位，而大约总人口的50％表达hla-a2分子，因此hla-a2限制性tcr可具有普遍的治疗用途。本发明筛选出的tcr可用于靶向乙型肝炎病毒表面抗原，且亲和性良好，使得原本不具备抗原特异性识别能力的t细胞可识别表达hbv表面抗原的细胞并对其进行杀伤，从而达到治疗hbv慢性感染或肝癌的目的。

19、本发明中筛选tcr的方法可单次获得多个tcr，具有筛选效率高和筛选成本低等优点，并且，获得的tcr可特异性识别抗原表位肽，尤其是当多个抗原表位肽来源于同一病毒或病原细胞时，该方法得到的多个tcr均可特异性识别该病毒或病原细胞，具有筛选效率高等优点。