一种基于RT-RAA技术的甲型流感病毒快速检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，特别提供一种基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测方法。

背景技术：

1、甲型流感病毒是一种分节段的，有囊膜包裹的负链rna病毒，属于正黏病毒科。甲型流感病毒基因组由8个片段组成，从大到小依次为pb2、pb1、pa、ha、np、na、m、ns共编码11种病毒蛋白。ha、na与np、m1、m2、pb1、pb2、pa共同构成病毒的组成成分，其基因组易发生突变和重组。根据甲型流感病毒表面糖蛋白的血凝素（hemagglutinin，ha）和神经氨酸酶（neuraminidase，na）不同，可以分为18个ha亚型（h1~h18）和11个na亚型（n1~n11），其中h1、h3在人群中广泛传播，h5、h7、h9在家禽体内流行广泛。自然界中甲型流感病毒的宿主范围相当广泛，猪、马、虎、水貂、狐狸、猫、鲸、禽类以及人体内都分离到甲型流感病毒，是人畜共患的重要呼吸道疾病病原。

2、目前，针对甲型流感病毒的检测方法主要为胶体金免疫层析法和实时荧光定量聚合酶链式反应（real⁃time quantitative polymerase chain reaction，real ⁃ timepcr）。胶体金法简便快速，出结果快，但其敏感性较低，体内流感病毒含量较低时可能漏检；某些特殊类型流感病毒变异株无法检测出来。real⁃time pcr 相较于免疫学方法灵敏度高且能区分具体亚型，但需要复杂精密的扩增仪和专业的技术人员，并且扩增时间较长，不适用于资源有限的基层。

3、本发明中的rt-raa技术检测时间短、灵敏度高、特异性强，同时不需要精密复杂的仪器设备，可以在疫病现场进行快速的检测。此外，该技术操作简单，经过简单培训就可熟练操作，非常适用于在基层或是条件较差的实验室进行甲型流感病毒的快速检测。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测方法。

2、本发明技术方案如下：

3、首先根据甲型流感病毒核酸序列的保守区域，设计检测甲型流感病毒的上游引物、下游引物和探针，并配置rt-raa的反应体系，按照检测反应条件进行扩增。其中上游引物、下游引物和探针的序列如下：

4、上游引物flu-a：taaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcg；

5、下游引物flu-a：gacaggattggtcttgtctttagccactcc；

6、探针flu-a：

7、aaagccgagatcgcacagagacttgaaga[fam-dt]g[thf]ta[bhq1-dt]ttgctggaaaga-c3-spacer；

8、其中探针自5′端起第30位碱基标记fam荧光基团，第31位碱基标记四氢呋喃位点，第34位碱基标记bhq1淬灭基团，3′端进行c3-spacer阻断修饰；

9、rt-raa的反应体系为，总体积为50μl体系，其中包括a buffer 25μl、上游引物2μl、下游引物2μl、探针0.6μl、模板5μl、ddh2o 12.9μl、b buffer 2.5μl，配置好反应体系并混匀之后进行上机检测；

10、检测的反应条件为：

11、步骤：预热；温度：42℃；时间/循环：40s；循环数：1；荧光信号采集：否；

12、步骤：扩增；温度：42℃；时间/循环：30s；循环数：40；荧光信号采集：是。

13、结果判定：样品出现明显的扩增曲线，结果即为阳性，未出现扩增曲线，结果即为阴性。

14、有益效果：

15、本发明所建立的方法在42℃条件下恒温孵育20min即可完成检测，最低可检测到3.18×102copies/μl的flu a重组质粒，并且与乙型流感病毒、新型冠状病毒、登革热病毒无交叉反应，具有灵敏性高、特异性强、检测时间快的特点。

技术特征：

1.基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测引物，其特征在于，所述的引物和探针的序列如下：

2.一种基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物序列。

3.一种基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测方法，其特征在于：根据甲型流感病毒基因序列的保守区域，设计检测甲型流感病毒的上游引物、下游引物和探针，并配置rt-raa的反应体系，按照检测反应条件进行扩增。

4. 按照权利要求3所述的基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测方法，其特征在于：所述的rt-raa反应体系为，总体积为50μl体系，其中包括a buffer 25μl、上游引物2μl、下游引物2μl、探针0.6μl、模板5μl、ddh2o 12.9μl、b buffer 2.5μl。

5.按照权利要求3所述的基于rt-raa技术的甲型流感病毒快速检测方法，其特征在于，检测的反应条件为：

技术总结
本发明提供一种基于RT‑RAA技术的甲型流感病毒快速检测方法，以实现对甲型流感病毒的快速、灵敏、特异的检测，RT‑RAA技术相较于荧光定量PCR技术来说，具有检测时间短、操作简便的优点，RT‑RAA技术不依赖于大型精密的仪器设备，非常适用于在基层或是条件较差的实验室进行检测。本发明所建立的方法42℃条件下恒温孵育20min即可完成检测，最低可检测到3.18×10<supgt;2</supgt;copies/μL的FLU A重组质粒，并且与乙型流感病毒、新型冠状病毒、登革热病毒无交叉反应。

技术研发人员：滕新栋,杨森,于滢泉,冯茹荔
受保护的技术使用者：青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21