利用mRNA的N4-胞苷酸乙酰化修饰调控细胞命运转化

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及利用mrna的n4-胞苷酸乙酰化修饰调控细胞命运转化。

背景技术：

1、细胞命运可塑性的研究对于生物学领域至关重要。细胞命运转变过程中涉及到广泛的基因网络调控和染色质景观变化。虽然人们在表观遗传调控和转录调控层面对细胞命运转变的相关机制已经投入较多的努力，但在转录后修饰对细胞命运的调控目前仍缺乏相关研究。此外，相对于广泛研究的在dna和组蛋白层面的表观遗传调控，rna层面的表观转录组调控对细胞命运转化的重要性近些年才引起人们的重视。对于这些不同层面的调控以及它们之间串扰的研究能够让更好地理解细胞命运转化，同时也能推动再生医学的发展。

2、n4-胞苷酸乙酰化(ac4c)修饰是近期发现信使rna内部的修饰，也是目前唯一已知的信使rna乙酰化修饰，但其在细胞命运转化，尤其是干细胞分化和体细胞重编程过程中的功能仍然未知。nat10是ac4c主要的乙酰化酶，它在干细胞分化和体细胞重编程的作用目前还未被系统研究。此外，目前检测ac4c修饰的技术方法目前较为单一，鉴于ac4c的修饰丰度较低及抗体的特异性有待提升，新的修饰检测方法亟待开发。

3、因此，本领域迫切需要探究nat10及其催化形成的mrna ac4c修饰在干细胞分化及体细胞重编程中的作用，开发控制细胞命运转化的新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供利用mrna ac4c修饰调控细胞分化和重编程的方法。

2、在本发明的第一方面，提供了一种n4-胞苷酸乙酰化(ac4c)修饰的抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于选自下组的一种或多种用途：

3、(a)抑制染色质调节因子的活性或水平，所述的染色质调节因子选自下组：anp32b、anp32a、anp32e、acin1、hnrnpc、pelp1、psip1、rnf20和paf1；

4、(b)调节二价基因的功能；

5、(c)抑制干细胞的分化进程；

6、(d)抑制体细胞的重编程进程。

7、在另一优选例中，所述n4-胞苷酸乙酰化(ac4c)修饰的抑制剂包括nat10抑制剂。

8、在另一优选例中，所述nat10抑制剂包括sirna、shrna、特异性敲除nat10的基因编辑试剂、靶向nat10的化学小分子抑制剂。

9、在另一优选例中，所述shrna的序列选自下组：

10、(1)gagatgtattcacggaatatg(seq id no:1)；

11、(2)cggccatctctcgcatctatt(seq id no:2)。

12、在另一优选例中，所述特异性敲除nat10的基因编辑试剂包括sgrna。在另一优选例中，所述sgrna的序列如下所示：gtgagttcatggtccgtagg(seq id no:3)。

13、在另一优选例中，所述靶向nat10的化学小分子抑制剂包括remodelin。

14、在另一优选例中，所述二价基因是同时含有h3k4me3和h3k27me3的基因。

15、在另一优选例中，所述二价基因包括选自下组的基因：sfrp1、nodal、或其组合。

16、在另一优选例中，所述调节二价基因的功能包括：

17、(i)上调选自下组的二价基因：nodal；

18、(ii)下调选自下组的二价基因：sfrp1。

19、在另一优选例中，所述干细胞的分化包括自发分化、定向分化、或其组合。

20、在另一优选例中，所述干细胞为人胚胎干细胞。

21、在另一优选例中，所述干细胞的分化包括谱系的分化。

22、在另一优选例中，所述分化包括胚胎干细胞自发分化为拟胚体、胚胎干细胞定向分化为胰腺前体细胞、或其组合。

23、在另一优选例中，所述的nat10抑制剂下调胰腺前体细胞的选自下组的mrna或蛋白水平：pdx1、nkx6.1、hnf6、sox9。

24、在另一优选例中，所述的nat10抑制剂下调ipsc细胞选自下组的mrna或蛋白水平：oct4、sox2、nanog、sall4、cdh1。

25、在另一优选例中，所述的nat10抑制剂上调ipsc细胞选自下组的mrna或蛋白水平：cdh2。

26、在另一优选例中，所述的nat10抑制剂上调选自下组的通路：p53信号通路、tnf信号通路、细胞黏着、蛋白酶体、或其组合。

27、在另一优选例中，所述的nat10抑制剂下调选自下组的通路：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；pi3k-akt信号通路；鞘脂代谢；嘌呤代谢；ras信号通路；hif-1信号通路；或其组合。

28、在本发明的第二方面，提供了一种nat10蛋白或其促进剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于选自下组的一种或多种用途：

29、(a)促进染色质调节因子的活性或水平，所述的染色质调节因子选自下组：anp32b、anp32a、anp32e、acin1、hnrnpc、pelp1、psip1、rnf20和paf1；

30、(b)调节二价基因的功能；

31、(c)促进干细胞的分化进程；

32、(d)促进体细胞的重编程进程。

33、在另一优选例中，所述调节二价基因的功能包括：

34、(i)下调选自下组的二价基因：nodal；

35、(ii)上调选自下组的二价基因：sfrp1。

36、在另一优选例中，所述方法包括：

37、(1)提供待检测mrna乙酰化的多核苷酸样品，用ac4c特异性抗体进行免疫共沉淀，形成ac4c特异性抗体－ac4c修饰mrna复合物；

38、(2)分离抗体－ac4c修饰mrna复合物；

39、(3)在ac4ctp存在下，进行竞争洗脱处理，从而将ac4c特异性抗体从所述复合物中解离出，并释放ac4c修饰mrna；

40、(4)分离所释放的ac4c修饰mrna；和

41、(5)对所述经分离的mrna，通过peak分析鉴定出ac4c修饰的位点。

42、在另一优选例中，在步骤(3)中，所述ac4ctp的终浓度为5-20mm，较佳地6-10mm，更佳地约6-8mm。

43、在另一优选例中，所述的ac4c特异性抗体是偶联于磁珠上的。

44、在另一优选例中，步骤(2)中，通过磁场进行分离。

45、在另一优选例中，步骤(4)中，通过沉淀进行分离。

46、在本发明的第三方面，提供了一种评估一个rna分子是否是nat10蛋白的底物的方法，包括步骤：

47、(a)对所述rna分子的序列进行搜寻是否存在选自下组的ac4c修饰基序：

48、(i)cxucxucxucxu

49、(ii)cxxcxxcxxcxx

50、x为选自a、g、c、u的任一核苷酸；

51、其中，如果存在所述的ac4c修饰基序，则表明该rna成为nat10蛋白的底物的几率高。

52、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

53、(b)将多核苷酸与nat10蛋白进行混合，并检测所述多核苷酸中对应于所述ac4c修饰基序的核苷酸序列是否发生了ac4c修饰；其中，如果发生ac4c修饰则表示所述多核苷酸是nat10蛋白的底物。

54、在另一优选例中，所述步骤(b)在乙酰基coa存在下进行酶催化反应。

55、在本发明的第四方面，提供了一种体外调控多能干细胞命运的方法，包括步骤：在n4-胞苷酸乙酰化(ac4c)修饰的抑制剂存在下，培养多能干细胞，从而调控所述多能干细胞的分化进程。

56、在另一优选例中，所述的多能干细胞包括ipsc。

57、在另一优选例中，所述n4-胞苷酸乙酰化(ac4c)修饰的抑制剂包括nat10抑制剂。

58、在另一优选例中，所述nat10抑制剂包括sirna、shrna、特异性敲除nat10的基因编辑试剂、靶向nat10的化学小分子抑制剂。

59、在另一优选例中，所述分化包括胚胎干细胞自发分化为拟胚体、胚胎干细胞定向分化为胰腺前体细胞、或其组合。

60、在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

61、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。