用于动态监测ctDNA的检测方法及其应用与流程

本发明涉及ctdna检测领域，具体地说是用于ctdna的检测方法及其应用。

背景技术：

1、循环肿瘤基因，即ctdna，是指肿瘤细胞体细胞dna经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，是一种特征性的肿瘤生物标记，通过ctdna检测，能够检出血液中的肿瘤踪迹，血浆中游离dna的总和称之为cfdna ，cfdna存在于人体的各种体液中，随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化，而来自肿瘤病人细胞释放到循环系统的cfdna包括ctdna。

2、现有大多检测都是利用影像学检测和mrd检测，也就是通过各种影像设备进行人体成像，从而帮助疾病诊断提供依据，包括x线检查、ct检查、mri、超声检查等，ctdna检测相比于影像学检测能够更早提示肿瘤复发，中位提前时间为88天，但是实体肿瘤mrd检测的难度较大，其原因就是肿瘤异质性、ctdna早期含量低和ctdna相对于组织丰度更低，更需要灵敏度极高的检测方法。

3、综上，因此本发明提供了用于ctdna的检测方法及其应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供用于动态监测ctdna的检测方法及其应用，以解决现有技术中实体肿瘤mrd检测难度大等问题。

2、为实现上述目的，本发明技术方案如下：

3、用于动态监测ctdna的检测方法及其应用，包括：

4、s1:dna取样，（1）先将细胞裂解与细胞裂解缓冲液裂解细胞膜，再将脂质被洗涤剂和表面活性剂分解；

5、（2）通过添加蛋白酶消化蛋白质，再通过添加 rnase 消化 rna，随后通过加入浓盐然后离心分离细胞碎片、消化蛋白质、脂质和 rna；

6、（3）最后用冰冷的乙醇或异丙醇乙醇沉淀 dna，醋酸钠的离子强度可用于改善沉淀，沉淀的 dna 在最终溶液中呈线状；

7、s2:扩增反应，在引物的指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是模拟体内dna复制过程，少量dna中难以检测出ctdna的问题，从复制扩增过程需要通过其他过程展现出来；

8、s3:附加扩增反应适配器，附加一个适配器将两个扩增反应设备与ngs库设备连接起来并与二者电流相匹配，能够使扩增反应设备与ngs库设备进行协同运作；其中附加的pcr扩增反应设备与ngs库工作站中的设备进行连接，使得扩增反应产生的数据能够快速输入到ngs库中，实现数据的快速传输。

9、s4:输入ngs库，将扩增反应后的dna输入库内，通常分为四个步骤，dna或rna片段剪切、末端修复和连接、文库扩增和纯化和文库质控，之后再对ctdna及肿瘤治疗过程进行监测。

10、优选的，述dna取样后进行mbda，所述mbda项目进行后进行纯化柱后，再进行扩增反应。其中mbda是一种多重抑制探针置换扩增技术，mbda技术仅需250x测序深度即可检测到vaf低至0.019%的低频基因变异。不同于其它突变等位基因富集技术，mbda 可以很好地扩展到多重panel（80重的扩增子的panel可以实现300倍的中位富集倍数）。经过mbda技术富集过后的文库，样本中低频变异等位基因的vaf得到放大，远远超过ngs系统误差，因此只需相对较低的测序深度，且不需要通过额外的错误校正，即可检测到低频变异，极大地提高了检测特异性；mbda的富集效率在不同样本、不同文库之间极其稳定，可以以95％的准确度精确定量2倍差异的初始样本变异。

11、优选的，所述扩增反应后给pcr添加适配器，pcr适配器添加结束后再进行一次纯化柱。

12、优选的，所述扩增反应适配添加后再进行pcr添加引物，所述pcr添加引物后再对安瓿珠的尺寸进行选择，而后对检测数据输入ngs库内。

13、优选的，所述输入ngs库中后对数据进行量子位与生物分析仪进行分析，之后再结合其他库中资料最终形成ngs。mbda-ngs技术大幅减少测序数据量（可减少100倍），可以让各种中低通量测序仪以较低的测序成本实现低频基因变异的检测。

14、优选的，所述的方法在mbda检测ctdna试剂盒中的应。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、1、本发明通过使用mbda-ngs法对混合细胞系进行检测，起始样本量为300ng基因组dna，lod最低可至0.019%；在变异序列比例方面（variant-read fraction ，vrf)，相比标准多重扩增子文库ngs测序法的0.2%，mbda法可达到30%，其富集效率在150倍以上（中位数300倍）；在中靶率基本相同的前提下（mbda 81.4% vs. 标准扩增子法 89.6%）， mbda法极大减少了检测所需的测序数据量，从而降低测序成本；与探针捕获法相比，mbda可将文库构建时间从24小时缩短至6小时，解决了实体肿瘤mrd检测难度大成本高等问题；

技术特征：

1.用于动态监测ctdna的检测方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述用于动态监测ctdna的检测方法，其特征在于：所述s1中dna取样后进行mbda，所述mbda项目进行后进行纯化柱后，再进行扩增反应。

3.如权利要求1所述用于动态监测ctdna的检测方法，其特征在于：所述s2中扩增反应后给pcr添加适配器，pcr适配器添加结束后再进行一次纯化柱。

4.如权利要求1所述用于动态监测ctdna的检测方法，其特征在于：所述s3中扩增反应适配添加后再进行pcr添加引物，所述pcr添加引物后再对安瓿珠的尺寸进行选择，而后对检测数据输入ngs库内。

5.如权利要求1所述用于动态监测ctdna的检测方法，其特征在于：所述s4中输入ngs库中后对数据进行量子位与生物分析仪进行分析，之后再结合其他库中资料最终形成ngs。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法在mbda检测ctdna试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及ctDNA检测领域，提供了用于动态监测ctDNA的检测方法及其应用，包括：DNA样本、扩增反应、添加扩增反应适配器、NGS库，通过DNA取样后进行mBDA后再进行纯化柱，而后形成扩增反应，再为PCR添加适配器后进行二次纯化柱，而后再为扩增反应添加适配器后，再为PCR添加索引，对安瓿珠尺寸进行选择，最后入NGS库；本发明通过扩增反应、纯化柱mBDA的运用解决了实体肿瘤MRD检测难度大成本高等问题。

技术研发人员：罗俊峰,汪进平,徐雪,刘香琼
受保护的技术使用者：阅尔基因技术（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25