一种去核间充质干细胞及其制备方法和应用

本发明涉及细胞领域，尤其涉及一种去核间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、类风湿性关节炎(ra)是近些年常见的一种系统性自身免疫性疾病，主要有由遗传、感染、环境、免疫等因素引发，可导致永久性残疾，其死亡率高于一般人群。流行病学调查显示在全球范围内ra发病率约为1％，且发病率逐年增加，死亡风险也过高。随着我国人口老龄化的日益加剧，ra将给个人、家庭和社会带来巨大的医疗和经济负担。然而传统药物疗效有限，不能改变长期病程、不能完全逆转疾病表现，以及存在胃肠道、心脏毒性、成瘾、内分泌失调和肥胖等副作用，治疗过程常见高成本但无效果的现象。发展到了晚期，只能实施关节置换手术，但是关节置换涉及重大侵入性手术，还存在血栓和感染的风险，而且费用昂贵，人工关节的功能效果也有限，置换的假体寿命有限，还可能需要二次手术更换。

2、mscs是一种具有自我更新、分化为多种细胞类型的多能干细胞。可以从多种围产组织和成体组织中提取获得。mscs通过旁分泌作用合成和释放多种生长因子和细胞因子，这些因子可能对病灶内局部微环境产生营养性旁分泌、抗炎症、刺激内源细胞增殖、增强细胞再生、血管增生、抑制细胞凋亡和抑制纤维化等作用，表现出调节免疫反应和抗炎能力，已被应用于治疗许多自身免疫性疾病。且mscs具有自我更新和分化为三胚层多种细胞的能力(包括软骨细胞)，可修复关节表面软骨和软骨下骨损伤。这些在免疫抑制关节修复方面的特殊优势、方便性和丰富的可用性，已逐渐广泛应用于自身免疫性疾病的治疗，是解决ra治疗中尚未解决的问题的有希望的靶点。

3、但mscs移植治疗安全性具有潜在的问题和风险，例如移植后出现不良增生，细胞具有异质性和免疫原性的不良影响。以及无法控制移植到体内的mscs的命运，其中mscs的不必要分化及其可能的恶性转化已被确定为mscs移植治疗最重要的安全问题。除此之外mscs还可能在恶性疾病的抗肿瘤免疫反应和新血管生成之间架起桥梁，从而促进肿瘤的生长和转移。mscs在静脉注射后主要局限于肺毛细血管，全身输注后mscs不一致且不充分地归巢到目标组织。这些被认为是mscs治疗效果不佳的主要原因。在过去的十年中，对于移植治疗相关的疾病，已经开发了部分较安全的运输载体。然而，这些载体已经被剥夺了发挥功能所需的关键细胞器。因此，现有的这些细胞载体也不能更好响应化学信号使自己迁移到受损组织从而达到最好的疗效。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提出通过生物工程技术密度梯度离心的方法，使mscs经基因修饰后物理去核，生成了一种具有趋化受体和治疗ra的分子的货物细胞去核mscccr2+/ifn-γ+，成为更精确靶向治疗的有效载体。该去核细胞既不会增殖，也不会永久留在宿主中，保留细胞器和大多数细胞功能，且能主动趋化迁移到已识别的趋化因子信号，使它们安全、可控，并受病变组织趋化因子的影响。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种去核间充质干细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

3、步骤(1)转染ccr2慢病毒和ifn-γ慢病毒至msc，得到稳定的mscccr2+/ifn-γ+细胞株；

4、步骤(2)利用胰酶消化收集mscccr2+/ifn-γ+，并在mem完全培养基中重悬，加入细胞松弛素b和秋水仙素溶液预处理，在细胞悬液中加入聚蔗糖溶液再次重悬；

5、步骤(3)将步骤(2)再次重悬后的细胞悬液铺在聚蔗糖多梯度溶液的梯度层上方，再覆盖mem；超速离心机中离心，结束后收集聚蔗糖多梯度溶液梯度层漂浮的去核mscccr2+/ifn-γ+(去核间充质干细胞)。

6、作为优选，步骤(1)转染ccr2慢病毒和ifn-γ慢病毒至msc的过程如下：生长状态良好的目的msc细胞消化计数后稀释至1-5×105/孔，24孔板铺板，放入37℃，5％co2培养箱中培养过夜，待细胞密度75-85％后，吸出细胞原有培养基，加入1/3-2/3体积新鲜培养基，然后从冰箱取出慢病毒融化，根据100-110moi(multiplicity ofinfection，感染复数)每孔加入70-80μl ccr2慢病毒和70-80μl ifn-γ慢病毒，同时加入3-10μg/ml的polybrene助转剂促进慢病毒转染效率，转染后70-75h后得到稳定的mscccr2+/ifn-γ细胞株。

7、作为优选，步骤(2)所述细胞松弛素b在细胞悬液中的浓度为10-30μg/ml，秋水仙素在细胞悬液中的浓度为5-20μg/ml。

8、作为优选，步骤(2)在细胞悬液中加入聚蔗糖溶液再次重悬，细胞悬液与聚蔗糖溶液的体积比为0.8-1.2：0.8-1.2，混合后聚蔗糖的浓度为12-13％。

9、作为优选，步骤(3)所述聚蔗糖多梯度溶液配制过程如下：聚蔗糖加纯水配成45-55％溶液，室温持续磁力搅拌20-30h，高压灭菌，保存至负二十度冰箱备用；用mem完全培养基稀释45-55％聚蔗糖溶液得23-28％聚蔗糖混合液；继续用mem稀释23-28％聚蔗糖混合液，配成16.8-17.5％、15.8-16.5％、14-15.5％、12-13％的低浓度聚蔗糖混合液；所有低浓度聚蔗糖混合液中均加细胞松弛素b浓度为8-12ug/ml；

10、将低浓度聚蔗糖混合液按照1.5-2.5ml 23-28％、1.5-2.5ml 16.8-17.5％、0.3-0.8ml15.8-16.5％、0.3-0.8ml 14-15.5％和1.5-2.5ml 12-13％的顺序依次加入到超净管中，并放入组织培养箱37℃，5％co2中平衡12～16h得到聚蔗糖多梯度溶液。

11、作为优选，步骤(3)超速离心条件如下：温度为30-33℃，离心速率为120000-130000g/min的条件下离心50-70min；超速离心结束后观察到梯度层中有悬浮的去核细胞，离心管底部有去除的细胞核；将悬浮着的细胞转移至普通离心管，在1500-2000rpm/min的条件下离心15-20min后，去除上清废液，收集细胞，得到去核人脐带来源间充质细胞去核mscccr2+/ifn-γ+。

12、作为优选，步骤(3)细胞悬液与聚蔗糖多梯度溶液和mem的体积比为3-4：6-8：2-4。

13、本发明还提供所述制备方法制得的去核间充质干细胞。

14、本发明还提供所述去核间充质干细胞在制备类风湿性关节炎、骨关节炎、类风软骨下损伤、骨质疏松症或滑膜炎药物中的应用。

15、本发明的特点：mscs与ifn-γ(干扰素-γ)联合治疗可以更好的提高了ra的治疗效果，mscs的免疫抑制功能可被ifn-γ激活。ra患者中treg/th17细胞比例低，导致机体免疫平衡失衡以及产生过度的炎症微环境。而mscs转基因过表达ifn-γ移植治疗可使treg/th17细胞比例迅速增加，treg细胞活性增强，进一步提高mscs免疫抑制功能，更有利于ra的治疗。这些结果都证明mscs联合ifn-γ治疗可能更好的提高治疗效果，且无任何不良副作用。与正常mscs和外泌体载体相比，ccr2(趋化因子)和其他治疗相关因子工程化的细胞显著优化了mscs的归巢问题，使得mscs具有较好的靶向性，可能更好的减轻炎症及病理表征。

16、本发明提供一种间充质干细胞有效去核的方法，制备过程中由水溶性聚蔗糖和秋水仙素共同作用预处理，改变细胞膜通透性，并且抑制细胞核功能。通过超高速离心在聚蔗糖密度梯度里可将细胞核与细胞质分离。分离后的无核细胞仍具有完整细胞器和一定细胞活性，可以携带因子继续存活。优化人脐带来源间充质干细胞的治疗局限性，在细胞移植治疗以及优化移植的安全性和有效性问题等领域具有潜在的应用价值。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的制备方法由水溶性聚蔗糖和秋水仙素共同作用预处理，能够更好地改变细胞膜通透性，并且抑制细胞核功能，得到的mscccr2+/ifn-γ+中msc与ifn-γ、ccr2联合作用，更好的提高类风湿性关节炎的治疗效果。