一种鼠抗人CDCA7单克隆抗体及其制备方法与应用

本发明涉及分子及分子生物学和生物，更具体地涉及一种鼠抗人cdca7单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、细胞分裂相关蛋白7(cell division cycle-associated protein7,cdca7，又称jpo1)编码基因位于2号染色体(chr2:173,354,820-173,368,997)，由371个氨基酸构成，分子量42,573da。cdca7在细胞核与细胞质中均有分布，在细胞周期中周期性表达，在g1至s期转变时达到峰值。cdca7的表达受c-myc和notch调节，并参与多能祖细胞的发育和分化、正常细胞周期和凋亡。先前评估体外细胞系转化、人类癌症中cdca7表达和转基因小鼠体内致瘤性的研究都支持cdca7在肿瘤发展中的重要性。

2、cdca7在其蛋白质结构中含有高度保守的4cxxc锌指结构域，该结构域可能在c-myc的控制下作为转录因子。尽管其转录调控活性低于c-myc，cdca7可以补充转化缺陷的myc box ii突变体的转录功能。目前尚无市售的针对cdca7的单克隆抗体，这使得难以通过诸如染色质免疫沉淀分析的方法准确鉴定cdca7的dna结合位点。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鼠抗人cdca7单克隆抗体及其制备方法和应用，解决了cdca7高亲和力抗体制备的问题，并且cdca7单克隆抗体可以用于通过染色体免疫共沉淀方法探索cdca7作为转录因子的研究，同时也可以作为乳腺癌耐药持续状态细胞的流式细胞检测分选和肿瘤组织免疫组化检测的一抗。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种制备cdca7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为cctcc no:c2023396。所述杂交瘤细胞株命名为hu-c7，培养物名称：杂交瘤细胞株hu-c7，由中国典型培养物中心保藏，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期：2023年12月21日。

4、本发明还提供由上述的杂交瘤细胞株分泌制备的cdca7单克隆抗体。

5、本发明所述的cdca7单克隆抗体，是鼠抗人cdca7特异性的单克隆抗体。

6、本发明还提供上述的cdca7单克隆抗体的制备方法，主要包含以下步骤：

7、1)设计与制备cdca7免疫原多肽；

8、2)用所制备的cdca7免疫原多肽免疫balb/c小鼠；

9、3)通过杂交瘤技术将所述步骤2)获得的balb/c小鼠的腹股沟淋巴结细胞与骨髓瘤细胞sp2/0经多次细胞融合，利用间接elisa法进行筛选阳性克隆，克隆化筛选出能稳定分泌cdca7单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

10、4)cdca7单克隆抗体腹水制备；

11、5)cdca7单克隆抗体纯化；

12、6)所述cdca7单克隆抗体亚类的鉴定；

13、7)所述cdca7单克隆抗体特异性鉴定。

14、所述步骤1)还包括：免疫原多肽序列位点设计在除cdca7锌指结构区域：247～371aa和cdca7与myc互作区域：146～170aa以外的区域,即1～145aa,171～246aa且具有较好的表面可及性、柔韧性、亲水性等的区域。

15、所述免疫原多肽优选为：cdca7-epitope43，cdca7-epitope75，cdca7-epitope339，其对应的多肽序列位点分别优选是：43-58:sdnfantrlqsvregc(seq id no:1)，75-89:kfparstrgatnkka(seq id no:2)，339-354:catgvlvylakyhgfg(seq id no:3)。其中优选地，免疫原多肽cdca7-epitope339可获得免疫原性最佳的单克隆抗体。

16、所述步骤2)还包括：所述balb/c小鼠为8周龄，雌性，经产小鼠。

17、所述步骤3)还包括：对所述balb/c小鼠进行首次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，其中所述首次免疫将步骤1)制备的cdca7免疫原肽与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合做免疫原，所述第二次免疫和所述第三次免疫分别将步骤1)制备的cdca7免疫原肽与等体积的弗氏不完全佐剂乳化混合做免疫原，所述加强免疫将步骤1)制备的cdca7免疫原肽做免疫原，各免疫原的剂量和给药途径不变。

18、所述步骤3)还包括：将腹股沟淋巴结分离细胞与骨髓瘤细胞混合，以聚乙二醇1450为融合剂，形成融合细胞，将融合细胞悬于含小牛血清的hat培养液中，并置5％co2细胞培养箱37℃培养。用所述间接elisa法进行筛选，筛选时，用真核表达的cdca7包被进行筛选，对检出的阳性克隆的细胞生长孔，采用有限稀释法进行细胞克隆化，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。

19、优选地，所述步骤6)中，所述cdca7单克隆抗体亚类为ig亚类。

20、本发明所述的方法包含用染色体免疫共沉淀技术在乳腺癌耐药细胞中从所述的cdca7单克隆抗体中筛选出cdca7作为转录因子所结合的核酸片段最佳的cdca7单克隆抗体的步骤，所述染色体免疫共沉淀技术使用cst公司的enzymatic chromatinip kit(magnetic beads)试剂盒完成，包括以下步骤：

21、(1)cdca7蛋白与dna交联。取对数生长期乳腺癌耐药细胞系，用1％甲醛室温固定细胞10分钟后用甘氨酸室温孵育5分钟，再用冷的pbs洗涤细胞2次，最后将细胞刮入含有蛋白酶抑制剂的pbs中，4℃，2,000g的速度离心5分钟，移除上清液，置于冰上。

22、(2)染色质片段制备。用enzymatic chromatin ip kit(magneticbeads)试剂盒中的缓冲液a复合物重悬细胞，冰上孵育10分钟，4℃，2,000g的速度离心5分钟，移除上清液，加入缓冲液a复合物重悬细胞，加入micrococcal nuclease，充分混匀后37℃下孵育20分钟。加入10μl 0.5m edta混匀，冰浴1～2分钟，终止消化。4℃，16,000g离心1分钟，使胞核沉淀，移除上清液，得到胞核沉淀物。将胞核沉淀物重悬于chip缓冲液，冰上孵育10分钟后进行冰浴超声处理。通过使用设置为6且配有1/8英寸探头的virtisvirsonic100ultrasonic homogenizer/sonicator，在3组20秒脉冲之后完全裂解。最后在4℃，9,400g离心10分钟，收集上清，得到染色质片段混合物。

23、(3)免疫沉淀反应。用chip buffer稀释步骤(2)获得的染色质片段混合物。每100ul为1份加入5支1.5ml离心管，分别加入阳性对照样品histone h3(d2b12)rabbitmab，阴性对照样品normal rabbit igg和权利要求3中获得的3个备选cdca7单克隆抗体，充分混匀后，在4℃下转动孵育过夜。之后，加入protein g magnetic beads并在4℃下转动孵育2小时。将各组离心管置于磁力架，静置1～2分钟至溶液澄清，移除上清液。向磁珠中添加1ml低盐洗液洗涤沉淀物protein g magnetic beads，然后在4℃下转动孵育5分钟。重复洗涤2次。向微珠中添加1ml高盐洗液4℃下转动孵育5分钟。将试管置于磁力架，静置1～2分钟至溶液澄清，移除上清液，收集沉淀物。

24、(4)解除dna-蛋白交联。各组沉淀中加入150ulchip洗脱缓冲液，充分混匀后加入6μl 5m nacl和2μlproteinase k并在65℃孵育2小时，解交联。

25、(5)dna纯化回收。在各组溶液中加入750μldna binding buffer混匀后加入dna离心柱，18,500g离心30秒后再向离心柱中添加750μl dna wash buffer，18,500g离心30秒，最后向离心柱中添加50μldna elution buffer并将其置于洁净的1.5ml离心管中。洗脱物即纯化的cdca7转录因子结合的dna。

26、(6)通过核酸检测仪检测所获取的dna片段的浓度和纯度。

27、本发明所述的cdca7单克隆抗体可以用于乳腺癌耐药持续状态细胞的流式细胞检测和分选；进一步地，本发明所述的cdca7单克隆抗体还可以用于检测乳腺癌耐药患者肿瘤组织中耐药持续状态细胞。

28、本发明的有益效果为：

29、1、以乳腺癌耐药持续状态细胞为模式细胞，设计并制备针对cdca7的特异性鼠抗人单克隆抗体。成功构建用于染色体免疫共沉淀实验的cdca7单克隆抗体2e9，为探究cdca7作为转录调控因子的下游靶基因及具体dna结合位点提供了高效特异的结合抗体。

30、2、流式细胞检测结果表明，本发明制备筛选获得的cdca7单克隆抗体2e9能够特异性识别乳腺癌耐药持续状态细胞。本发明制备的cdca7单克隆抗体可用于耐药持续状态细胞的检测和分选。

31、3、免疫组化结果表明，本发明制备筛选获得的cdca7单克隆抗体2e9能够特异性识别乳腺癌肿瘤组织中的耐药持续状态细胞。本发明结果为进一步研究乳腺癌耐药细胞促进肿瘤进展的作用机制提供了有效的实验手段。