一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用

本发明涉及分子生物学和生物，特别是涉及一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、溶菌酶是1922年由英国科学家fleming首先在人的唾沫、眼泪和鼻涕中发现的，因其可使细菌细胞壁溶解而得名。肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞壁的一种重要成分。溶菌酶可水解肽聚糖中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物溢出而使细菌溶解。因此，溶菌酶能杀灭大多数的革兰氏阳性菌株。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶具有抗菌、消炎、抗病毒、止血、消肿、镇痛等作用。溶菌酶的这些特殊性质使其在食品、医学、畜牧生产等工业中有着广泛的应用前景。目前，基于廉价易得的原因，鸡蛋清溶菌酶(简称，蛋清溶菌酶)是应用最为广泛的、商业化的溶菌酶制剂。

2、人溶菌酶是人体自身的一种杀菌的蛋白质。人溶菌酶与其他来源的溶菌酶相比，有许多无法逾越的优势：如酶活性是蛋清溶菌酶的3倍；并且来源于人体，和人体具有天然相容性，不会产生任何副作用和免疫原性，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收；对机体无毒性，也不会在体内残留，安全性更高。因此在食品、医药和饲料行业越来越受到更多的青睐。

3、里氏木霉是重要的工业生产菌株，符合gras(generally regarded as safe)标准，其发酵生产的酶制剂已被广泛应用于食品、饲料等行业。已知学术研究领域未报道里氏木霉菌株可以发酵生产人溶菌酶。

4、现有技术虽然有利用酵母等真菌异源表达蛋清溶菌酶成功的案例，但利用真菌(尤其是里氏木霉)异源表达人溶菌酶的技术还尚未出现。其原因可能在于：首先，人溶菌酶对几丁质等葡聚糖的活力远高于蛋清溶菌酶，因此对真菌宿主产生一定的的杀伤力，导致异源表达失败。其次，分泌表达需要分泌肽，商业化的菌株(如大肠杆菌、毕赤酵母)有成熟高效的分泌肽，而非商业化的菌株(如里氏木霉等)是否具有类似的分泌肽，还尚属未知。

5、本发明拟利用里氏木霉分泌表达人溶菌酶，从而为开发人溶菌酶制剂提供新的技术思路。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该里氏木霉工程菌可以分泌表达人溶菌酶，从而可用于人溶菌酶制剂的生产。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌的构建方法，包括将表达模块转化到里氏木霉原始菌株中，构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；

4、所述表达模块包括依次连接的启动子、融合基因和终止子；所述融合基因包括依次连接的分泌肽基因、肽切割位点基因和人溶菌酶基因；

5、所述分泌肽基因为编码分泌肽的基因，所述分泌肽的氨基酸序列如seq id no.6～13中任一项所示；

6、所述肽切割位点基因为编码肽切割位点的基因，所述肽切割位点的氨基酸序列如seq id no.14～18中任一项所示；

7、所述人溶菌酶基因为编码人溶菌酶的基因，所述人溶菌酶的氨基酸序列如seq idno.1～5中任一项所示。众所周知，在本领域中，用性能相近或相似的氮基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。因此，人溶菌酶的氨基酸序列还包括具有与人溶菌酶相同功能的seqid no.1～5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为l-30个，较佳地1-20个，更佳地l-10个，最佳地l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为l0个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

8、进一步地，所述分泌肽基因的核苷酸序列如seq id no.28～35中任一项所示；所述肽切割位点基因的核苷酸序列如seq id no.36～40中任一项所示；所述人溶菌酶基因的核苷酸序列如seq id no.23～27中任一项所示。

9、进一步地，所述里氏木霉原始菌株包括里氏木霉qm6a、qm9414、rut-c30、rl-p37、ng14或pc-3-7。

10、进一步地，所述启动子为cbhi启动子或cbhii启动子，所述终止子为cbhi终止子或cbhii终止子；当所述所述启动子为cbhi启动子时，所述终止子为cbhi终止子；当所述启动子为cbhii启动子时，所述终止子为cbhii终止子；

11、所述cbhi启动子、所述cbhi终止子、所述cbhii启动子和所述cbhii终止子的核苷酸序列分别如seq id no.19～22所示。

12、进一步地，所述分泌肽基因的核苷酸序列如seq id no.34所示；所述肽切割位点基因的核苷酸序列如seq id no.36所示；所述人溶菌酶基因的核苷酸序列如seq id no.23所示；所述里氏木霉原始菌株为pc-3-7。

13、本发明还提供一种上述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。

14、本发明还提供上述的里氏木霉工程菌在制备人溶菌酶制剂中的应用。

15、本发明还提供一种人溶菌酶突变体，氨基酸序列如seq id no.2～5中任一项所示。

16、本发明还提供上述的人溶菌酶突变体在制备抑菌酶制剂中的应用，所述抑菌酶制剂针对的病原菌包括肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和/或副溶血弧菌。

17、本发明还提供一种抑菌酶制剂，活性成分包括上述的人溶菌酶突变体。

18、由于密码子的简并性存在(简并性是指，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列)，所以与seq id no.23～40中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出所述的序列。因此，本发明中术语“融合基因”还包括与seqid no.23～40中核苷酸序列的同源性至少92％的核酸序列。

19、本发明公开了以下技术效果：

20、本发明构建了人溶菌酶融合基因和表达模块，并将表达模块转化到多种里氏木霉菌株中，成功构建得到了分泌表达人溶菌酶的工程菌株。该工程菌株可用于人溶菌酶制剂的生产，通过实验验证，该人溶菌酶酶制剂可以显著杀灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。本发明为食品、饲料等行业提供了新的人溶菌酶制剂及其制备方法。

技术特征：

1.一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括将表达模块转化到里氏木霉原始菌株中，构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述分泌肽基因的核苷酸序列如seqid no.28～35中任一项所示；所述肽切割位点基因的核苷酸序列如seq id no.36～40中任一项所示；所述人溶菌酶基因的核苷酸序列如seq id no.23～27中任一项所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述里氏木霉原始菌株包括里氏木霉qm6a、qm9414、rut-c30、rl-p37、ng14或pc-3-7。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述启动子为cbhi启动子或cbhii启动子，所述终止子为cbhi终止子或cbhii终止子；当所述所述启动子为cbhi启动子时，所述终止子为cbhi终止子；当所述启动子为cbhii启动子时，所述终止子为cbhii终止子；

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述分泌肽基因的核苷酸序列如seqid no.34所示；所述肽切割位点基因的核苷酸序列如seq id no.36所示；所述人溶菌酶基因的核苷酸序列如seq id no.23所示；所述里氏木霉原始菌株为pc-3-7。

6.一种根据权利要求1-5任一项所述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。

7.一种如权利要求6所述的里氏木霉工程菌在制备人溶菌酶制剂中的应用。

8.一种人溶菌酶突变体，其特征在于，所述人溶菌酶突变体的氨基酸序列如seq idno.2～5中任一项所示。

9.一种如权利要求8所述的人溶菌酶突变体在制备抑菌酶制剂中的应用，其特征在于，所述抑菌酶制剂针对的病原菌包括肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和/或副溶血弧菌。

10.一种抑菌酶制剂，其特征在于，活性成分包括权利要求8所述的人溶菌酶突变体。

技术总结
本发明公开了一种分泌表达人溶菌酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，涉及分子生物学和生物技术领域。该构建方法包括将表达模块转化到里氏木霉原始菌株中，构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；所述表达模块包括依次连接的启动子、融合基因和终止子；所述融合基因包括依次连接的分泌肽基因、肽切割位点基因和人溶菌酶基因。本发明成功构建了分泌表达人溶菌酶的工程菌株，该工程菌株可用于人溶菌酶制剂的生产，通过实验验证，该人溶菌酶酶制剂可以显著杀灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。本发明为食品、饲料等行业提供了新的人溶菌酶制剂及其制备方法。

技术研发人员：王玮,蔡万钏,陈雨蒙
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27