一株抑制甲壳类动物急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌噬菌体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一株抑制甲壳类动物急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌噬菌体及其应用，本申请首次筛选得到的噬菌体对引发甲壳类动物急性肝胰腺坏死的副溶血弧菌具有杀灭作用，可用于控制水产甲壳类动物急性肝胰腺坏死病。

背景技术：

1、近几年随着水产集约化养殖的快速发展，水产养殖动物病害问题日益突出，其中弧菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成巨大的损失。

2、急性肝胰腺坏死合综合症(acute hepatopancreas necrosis syndrome,ahpns)是近年来影响甲壳类动物养殖业发展的重要疾病之一。2013年，全球水产养殖联盟(globalaquaculture alliance,gaa)发表声明，明确了ahpns的病原体是副溶血弧菌。据报道，该病原菌通过效应蛋白pira与pirb产生毒力，病虾消化器官颜色苍白，肝胰腺萎缩，空肠空胃，发病1～3天内死亡率可达到100％。

3、2014年，关于急性肝胰腺坏死合综合症的病原学取得了重要研究进展，罗竹芳教授通过研究报告验证了lightner等研究团队关于ahpns与特异性副溶血性弧菌的相关性的研究(lightner d v，redman r m，pantoja c r，et al.early mortality syndromeaffects shrimp in sia[c].global aquaculture advo-cate，2012，15：40.)，引起ahpns是一种特异性的副溶血弧菌，其含有的pva1质体带有与杆菌属相关的杀昆虫毒素(photorhabdus insect-related，pir)pira和pirb，其主要是破坏肝胰腺细胞，导致肝胰腺功能障碍；而其它不含有pira和pirb的副溶血弧菌无法引起对虾或其它水产甲壳类动物产生ahpns相关病症。现目前相关报道多是与对虾或蟹类等甲壳类动物的ahpns报道，还未有其它水生动物发生该病的研究进展。

4、而现有报道中尚未有针对急性肝胰腺坏死副溶血弧菌的噬菌体及其生物制剂，基于此，本发明通过筛选得到的副溶血弧菌噬菌体vpp2310006，通过研究其生物学特，为水产养殖弧菌病，特别是急性肝胰腺坏死的生物控制提供新的方法。

技术实现思路

1、为了预防甲壳类动物养殖过程中由副溶血弧菌引起的急性肝胰腺坏死疾病，降低由该病引起的死亡率，本发明提供一株针对甲壳类急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus phage)vpp2310006，所述噬菌体的保藏编号为cctcc no：m20231413。

2、本发明的另一个目的在于提供了副溶血弧菌噬菌体vpp2310006在制备治疗或预防副溶血弧菌感染引起的疾病的药物中的应用，所述的副溶血弧菌含有pira基因和pirb基因。

3、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

4、副溶血弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus phage)vpp2310006的筛选：

5、申请人自山东省潍坊市周边海域水体中，分离出一株副溶血弧菌噬菌体vpp2310006，噬菌体形态如图1所示，其与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为1mm。

6、该噬菌体已于2023年11月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：副溶血弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus phage)vpp2310006，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：cctccno：m20232374。

7、本发明的保护范围还包括：

8、包含副溶血弧菌噬菌体vpp2310006的复配物。

9、副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)抑菌剂中的应用；

10、副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备治疗或预防副溶血弧菌感染引起的疾病的药物中的应用；

11、以上所述的应用，优选的所述的疾病为急性肝胰腺坏死病和/或副溶血弧菌引发的弧菌疾病；

12、副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备拮抗副溶血弧菌饲料或饲料添加剂中的应用；

13、以上所述的应用，优选的，所述的副溶血弧菌含有pira基因和pirb基因。

14、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

15、1)本发明首次筛选出可对含有pira基因和pirb基因的副溶血弧菌具备广谱抑制效果的副溶血弧菌噬菌体，该噬菌体vpp2310006对急性肝胰腺坏死副溶血弧菌具有高裂解率，可裂解36株vpahpnd(vibrio parahaemoly-ticus causing ahpnd，vpahpnd)中的33株，裂解率为91.67％，在三疣梭子蟹等甲壳类水产养殖动物的vpahpnd感染的防控方面有很好的效果。副溶血弧菌噬菌体vpp2310006能裂解30株其它副溶血弧菌(不含piravp和pirbvp毒力基因)中的28株，裂解率为93.3％,；在对所有66株副溶血弧菌的裂解实验中，vpp2310006能裂解其中的61株，裂解率为92.4％。实验结果证实该株噬菌体在对副溶血弧菌的抑制卓有成效，对今后养殖业的副溶血弧菌防控及治疗具有重大参考意义

16、2)噬菌体vpp2310006具有高发酵率，在最佳感染复数moi＝0.01时，发酵5h，效价可达7.3×1011pfu/ml，对工业发酵提供了理论基础；

17、3)噬菌体vpp2310006具有良好的环境耐受性，副溶血弧菌噬菌体vpp2310006在ph为5-10范围内处理2h至24h其效价无明显数量级变化，ph为4-11处理2h后仍具有较高效价；副溶血弧菌噬菌体vpp2310006在温度为50℃及以下存活时间较长，在4℃条件下噬菌体效价在24h后效价无明显数量级差异，在4-37℃具有良好的稳定性。

18、更详细的技术方案见《具体实施方式》的内容。

技术特征：

1. 一株分离得到的副溶血弧菌噬菌体（vibrio parahaemolyticus phage）vpp2310006，所述噬菌体的保藏编号为：cctcc no：m20232374。

2.包含权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体vpp2310006的复配物。

3. 权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）抑菌剂中的应用。

4.权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备治疗或预防副溶血弧菌感染引起的疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的疾病为急性肝胰腺坏死病和/或副溶血弧菌引发的弧菌疾病。

6.权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体vpp2310006或其复配物在制备拮抗副溶血弧菌的饲料或饲料添加剂中的应用。

7.根据权利要求3或4所述的应用，所述的副溶血弧菌含有pira基因和pirb基因。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株抑制甲壳类动物急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌噬菌体及其应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M20232374。本发明首次筛选出可对含有pirA基因和pirB基因的副溶血弧菌具备广谱抑制效果的副溶血弧菌噬菌体，该噬菌体VPP2310006对急性肝胰腺坏死副溶血弧菌具有高裂解率，可裂解36株VpAHPND中的33株，裂解率为91.67%，具有增值效价高、裂解谱广、安全高效、对温度和pH值的耐受能力较好。本发明能有效预防甲壳类动物养殖过程中副溶血弧菌引起的急性肝胰腺坏死病，为副溶血弧菌的噬菌体疗法提供优良的菌株资源和大规模发酵生产的生物预防措施。

技术研发人员：王喜亮,田甲,黄金梅,张圣海,张秀玲,周好,张晓东
受保护的技术使用者：武汉格瑞农生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24