一种酵母异源表达的重组人源胶原蛋白及其制备方法

本发明涉及生物工程，涉及一种酵母异源表达的重组人源胶原蛋白及其制备方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是一种生物大分子蛋白，广泛分布于动物结缔组织，是人体皮肤组织中重要的组成成分，ⅰ型胶原蛋白占比80％～85％，ⅲ型胶原蛋白占比8％～11％。在皮肤中，胶原蛋白以胶原纤维的形式存在，其独特的物理性质赋予皮肤结构的完整性，在真皮层形成致密的胶原纤维网络，赋予皮肤弹性和紧致感。在衰老过程中，皮肤胶原蛋白流失，导致皮肤弹性下降，并在外观上出现皱纹。目前已有许多研究表明，通过外源补充胶原可弥补衰老过程中的胶原流失。因此，胶原蛋白在医美领域有着广泛应用。

2、近年来，基因工程技术被应用于胶原蛋白生产，通过选择人源胶原蛋白基因作为目的基因，构建表达载体，利用宿主菌表达外源胶原蛋白，实现胶原蛋白的大规模生产。利用基因工程技术制备胶原蛋白有以下方面优势：1)通过筛选目的基因，可以根据需求表达动物源或人源的胶原蛋白，并精准表达单一种类的胶原蛋白；2)工程菌培养所需的培养基成分较为便宜易得，产量不受原料限制，通过改进生产工艺可实现大规模快速生产；3)有效避免动物源疾病、兽药残留，杜绝安全隐患，可表达生产人源胶原蛋白，生物利用率高、安全性高。

3、目前利用工程菌表达重组人源蛋白主要采用大肠杆菌、酵母菌等。其中多数为人源胶原蛋白全链表达，如cn 202310368832.8；或选择部分片段，重复连接后表达，再酶解得到小分子胶原肽，如cn 202210100932；再或者对人源胶原蛋白氨基酸序列进行修饰后表达，如cn 202210739807。

4、基质金属蛋白酶(mmps)是锌依赖性内肽酶家族中的一类，能降解细胞外基质(ecm)几乎所有成分，其中mmp-1、mmp-8、mmp-13为胶原蛋白酶，mmp-2、mmp-9为明胶酶。有研究表明，在皮肤中的角质形成细胞和真皮成纤维细胞可分泌mmps。在光老化过程中，紫外线辐射诱导真皮成纤维细胞产生活性氧(ros)，进而促进mmp-1表达；此外，紫外线诱导激活蛋白-1(ap-1)激活，增强mmp-1、mmp-3、mmp-9表达。mmps参与光老化，是造成皮肤中胶原流失的重要原因之一，其中mmp-1的酶切位点为gly-|-ile。目前尚没有针对mmp-1酶切位点进行修饰的重组胶原蛋白。

5、因此，开发一种针对mmp-1酶切位点进行修饰的重组胶原蛋白极具现实意义。

技术实现思路

1、由于现有技术存在上述缺陷，本发明提供了一种针对mmp-1酶切位点进行修饰的重组胶原蛋白，为当前重组胶原蛋白技术领域提供一种全新的产品。

2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种酵母异源表达的重组人源胶原蛋白，包括依次串联的多个重组人源胶原蛋白单体；

4、所述重组人源胶原蛋白单体的氨基酸序列如seq id no:1所示，

5、seq id no:1(重组人源胶原蛋白单体的氨基酸序列)具体为：gppgpagqdgppgppgppgar。上述重组人源胶原蛋白单体的氨基酸序列来源于人源ⅰ型胶原蛋白部分片段，并对其进行氨基酸修饰，避免mmp-1酶切位点。重组人源胶原蛋白单体首尾相连时形成胰蛋白酶酶切位点。

6、本发明利用基因工程技术表达一种新的重组胶原蛋白，通过对人源胶原蛋白氨基酸片段进行筛选，对一个或多个氨基酸进行替换，避免mmp-1酶切位点和排异反应，提高生物活性和生物利用率，应用前景好。

7、作为优选的技术方案：

8、如上所述的一种酵母异源表达的重组人源胶原蛋白，所述重组人源胶原蛋白单体的数量为10～30个。当然其数量也可为5～50次，本领域技术人员可根据实际需求进行设定。

9、如上所述的一种酵母异源表达的重组人源胶原蛋白，所述重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、seq id no:2(重组胶原蛋白氨基酸序列)具体为：

11、gppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgargppgpagqdgppgppgppgar。

12、本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的重组人源胶原蛋白。

13、作为优选的技术方案：

14、如上所述的一种核酸分子，包括如seq id no:3所示的核苷酸序列。该核苷酸序列带有易于纯化的6×his标签且其根据毕赤酵母密码子偏好优化所得。

15、seq id no:3(重组胶原蛋白核苷酸序列)具体为：

16、ggaccacctg gcccagctgg tcaagacggt cctccaggac caccaggacc tccaggtgctagaggacctc ctggacctgc aggtcaagac ggtccacctg gtccaccagg accaccaggt gcaagaggtccccctggccc tgctggacaagatggtccac caggccctcc tggaccacca ggtgcaagag gaccaccaggtccagcaggt caagatggac cacctggtcc acctggtcca cctggtgcac gtggtcctcc aggtcctgcaggtcaggacg gaccaccagg accacctggt ccacccggtg ctagaggacc ccctggtcct gctggtcaggacggacctcc tggtcctcct ggtccacctg gtgcaagagg tccaccaggt cctgccggac aagatggtcctccaggtcca ccaggaccac ctggagctcg aggtcctccc ggaccagctg gacaagatgg acctcccggtcctcctggtc ctcctggagc tagaggacca cctggaccag ctggtcagga tggtccccct ggaccaccaggtccaccagg agcacgtgga cctccaggcc ctgcaggaca ggatggacct ccaggtcccc caggtccaccaggtgctaga ggtccaccag gtcctgctgg ccaagatgga cctccaggtc ctccaggacc tccaggagccagaggaccac caggaccagc tggccaagat ggtccacccg gacctccagg tccacctggt gctcgtggtccaccaggacc tgctggacaa gatggaccac ctggtccccc aggacctcct ggagcaagag gtcccccaggaccagcaggt caagacggtc ctccaggccc acctggacct ccaggtgctc gaggaccacc aggtcctgcaggccaagacg gtccacctgg acctcctgga ccccctggag caaggggtcc acctggacct gctggtcaagatggtcctcc aggaccacct ggtccaccag gtgctagggg tcctccaggt cccgctggtc aagacggtccaccaggtcct ccaggtcctc ctggagctag aggtccaccc ggtcctgctg gtcaagatgg accaccaggtccaccaggtc ctccaggtgc cagaggacct ccaggaccag ctggtcaaga tggacctcct ggtcctccaggaccccctgg tgctagaggt ccacctggac cagcaggaca ggatggtcct ccaggtcctc caggacccccaggtgcaaga ggacctcctg gtcctgctgg ccaagacgga ccccctggtc cacctggacc accaggagctaggggtccac ctggtcctgc cggtcaagat ggaccacccg gaccacctgg tcctcctggt gcaagaggaccacccggtcc agctggtcag gatggaccac ccggtcctcc tggaccacct ggtgctcgag gtcctcccggacctgcagga caagacggtc caccaggtcc acctggtcct cctggagcaa gaggtccacc aggaccagcaggacaagatg gacctccagg ccctcctgga cctcctggtg ctcgacatca tcatcatcat catatt

17、本发明还提供含有至少一个如上所述的核酸分子的重组表达载体质粒。

18、本发明还提供含有至少一个如上所述的核酸分子或者如上所述的重组表达载体质粒的宿主细胞。该宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选真核细胞，优选毕赤酵母，所述毕赤酵母工程菌为gs115-ppic9k-col。

19、此外，本发明还提供一种制备如上所述的重组人源胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

20、(1)将编码所述重组人源胶原蛋白的核酸分子连入载体中，构建重组表达载体质粒，将所述重组表达载体质粒转入宿主细胞中，筛选，得到多拷贝阳性转化子；

21、(2)培养多拷贝阳性转化子，在发酵液中添加诱导剂进行诱导处理，诱导表达后收集发酵液；

22、(3)对发酵液进行离心、微滤膜过滤、超滤除杂以及纯化后即得所述酵母异源表达的重组人源胶原蛋白。超滤除杂即得重组胶原蛋白粗液，其中重组胶原蛋白的表达量可达到5～10g/l，在诱导表达过程中进一步补加酵母酵母提取物和混合氨基酸溶液可进一步提高重组胶原蛋白的表达量，可达到15g/l。

23、作为优选的技术方案：

24、如上所述的方法，所述宿主细胞为毕赤酵母工程菌；

25、所述培养多拷贝阳性转化子的操作如下：

26、1)将多拷贝阳性转化子接种于ypd培养基中培养过夜；

27、2)再将步骤1)培育的菌体转接于bmgy培养基中，培养过程中初始甘油耗尽后补加甘油，当菌体浓度升高达到指标后，停止补加甘油，使菌体饥饿一段时间后离心，收集菌体；

28、所述诱导处理的操作为：将步骤2)所得的菌体投入bmmy培养基中诱导表达，表达过程中补加甲醇诱导表达重组人源胶原蛋白，通过补加酵母提取物和氨基酸溶液可进一步提高表达量；

29、所述纯化为镍柱纯化或醇沉纯化。

30、如上所述的方法，所述培养以及诱导处理的温度为28～29℃；

31、步骤2)是在发酵罐中进行的，培养条件为：ph4.5～6.0，搅拌桨转速300～700rpm，空气通量1.0～1.5l/min；

32、所述ypd培养基的组成为：2wt％胰蛋白胨、1wt％酵母提取物、2wt％葡萄糖以及余量的水；

33、所述bmgy培养基的组成为：2wt％胰蛋白胨、1wt％酵母提取物、0.23wt％磷酸氢二钾、1.18wt％磷酸二氢钾、1wt％甘油、1.34wt％ynb、0.004wt％生物素以及余量的水；

34、所述bmmy培养基的组成为：2wt％胰蛋白胨、1wt％酵母提取物、0.23wt％磷酸氢二钾、1.18wt％磷酸二氢钾、1wt％甲醇、1.34wt％ynb、0.004wt％生物素以及余量的水。

35、以上技术方案仅为本发明的一种可行的技术方案而已，本发明的保护范围并不仅限于此，本领域技术人员可根据实际需求合理调整具体设计。

36、上述发明具有如下优点或者有益效果：

37、本发明筛选人源胶原蛋白氨基酸序列片段，通过对一个或多个氨基酸进行替换修饰，避免mmp-1酶切位点，同源性＞90％，得到一种排异反应低、生物活性高和生物利用率高的重组胶原蛋白；通过对氨基酸序列进行密码子优化，导入毕赤酵母表达系统，提供了一种不含内毒素、生产成本低且产量大的重组胶原蛋白制备方法，应用前景好。