一种MIC蛋白及ULBP蛋白二价纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种mic蛋白及ulbp蛋白二价纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、主要组织相容性复合体i 类分子链相关基因(major histocompatibilitycomplex class i chain-related gene, mic) 定位于人类第6 条染色体短臂上(6p21.3)，是跨越mhc-i类区域2mb 长度的非经典hla-i 类基因家族。mic 基因家族包括mica，micb，micc，micd，mice，micf 和micg 7 个成员，其中只有mica、micb为功能基因，具有编码、转录和表达功能，余者5个由于点突变和缺失突变为假基因。包括5个内含子和6 个外显子，外显子1 编码l 前导肽，外显子2-4 分别编码细胞外α1、α2 和α3 3个球状结构域，外显子5 编码跨膜区(tm)，外显子6 编码胞质尾部结构。

2、mica 基因编码的产物是一条含有383 个氨基酸、相对分子质量为43kda 的高度糖基化的蛋白质分子。mica/b 高度多态性，mica 有超过100种多态性，而micb 也超过33种可识别等位基因（hla.alleles.org/classo.html 2019）。 micb 含 3 个可变的胞外域，1 个跨膜区域和 1个羧基尾端。胞外区域也包括α1、α2 和α3 3个结构域。虽然 mica/b的基因长度有一定差距，但在二者起始密码子上游一段长度约 1500 bp 的区段中，彼此约有90%的同源性，并且 mica/b 在近端均含有1个热休克蛋白元件（王健，2018）。肿瘤患者的血清中的smica是由于金属蛋白酶的细胞外表面部分被水解后引起膜mica的脱落而形成smica。多种肿瘤细胞可利用基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，mmps)、去整合素-金属蛋白酶(a disin-tegrin and metalloproteases，adams) 水解细胞表面mica/b蛋白分子生成 smica/b。smica 能够破坏nk细胞介导的肿瘤杀伤作用。有研究发现多发性骨髓瘤患者中，smica可引起nkg2d下调和淋巴细胞毒性受损，引起nkg2d的免疫抑制。同时，mgus（恶性单克隆丙种球蛋白病）患者产生高滴度的抗-mica抗体拮抗smica的抑制作用，刺激恶性浆细胞的树突状细胞交叉递呈作用。内源性的anti-mica抗体及mica的脱落是患者由mgus（monoclonalgammopathy of undetermined significance）转为mm的主要原因。作者认为抗-mica抗体能够有效重建免疫平衡和免疫监控（masahisa jinushi，2008）。总之，smica 对nkg2d的免疫监视起到了抑制作用。通过吸附作用降低smica的含量，有利于肿瘤患者的恢复。

3、在人类中，nkg2d配体除了mica和micb外，还有人类巨细胞病毒糖蛋白 ul-16 结合蛋白( ul-16 binding protein，ulbp) ，又名raet1蛋白，包括六个不同的ulbps蛋白（ulbp1~6），该配体蛋白也位于人类6号染色体上。ulbp 分为表达于组织细胞膜上的 m-ulbp(membrane ulbp)和血液中游离的s-ulbp（soluble ulbp）。有研究发现，肿瘤患者血清中的游离形式的s-ulbp 蛋白增多一方面是由于基质金属蛋白酶或磷脂酶 c 的溶蛋白性裂解作用所致，另一方面是通过溶酶体依赖的方式释放到胞外导致，而游离 ulbp 蛋白能够结合到自然杀伤细胞表面的 nkg2d 受体上，通过影响自然杀伤细胞受体的功能而影响其杀伤作用。所以，sulbp同样对nkg2d的免疫监视起到了抑制作用。据此，有研究者设计将抗mic蛋白纳米抗体和抗ulbp蛋白纳米抗体连接起来，做成融合蛋白，偶联至固相载体上做成免疫吸附剂，同时吸附mica、micb和ulbp分子，可能成为一种新的抗肿瘤治疗方法。

4、1993年hamers 报道了在骆驼科动物体内发现了一种天然缺失轻链的抗体即重链抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区（variable domain of heavy chain of hcabs，vhhs）构成，所以也称为vhh 抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段。vhh包括4段框架区(fr1～fr4)和3段互补决定区(cdr1～cdr3)。vhh 抗体相对分子质量约15k da，仅为常规抗体的 1/10，其分子高度 4.8nm，直径在 2.2nm，故又称为纳米抗体（nanobody）纳米抗体不仅有分子量小、物理稳定性高、容易表达等特性优点，而且不易聚集沉淀，还保留了与抗原结合的能力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种抗mic蛋白的纳米抗体、mic蛋白及ulbp蛋白二价纳米抗体及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：

4、一种抗mic蛋白的纳米抗体，其cdr1～cdr3的氨基酸序列如下：

5、cdr1：sfdaw（seq id no.：1）、cdr2：slsdyynksvyadsvkg（seq id no.：2）、cdr3：gpdyfderay（seq id no.：3）；或

6、cdr1：awsry（seq id no.：4）、cdr2：gttwddtlkvyadsvkg（seq id no.：5）、cdr3：wygrtfdayn（seq id no.：6）；或

7、cdr1：gmyam（seq id no.：7）、cdr2：gnkyrtnpsvyadsvkg（seq id no.：8）、cdr3：gydgrtfeay（seq id no.：9）；或

8、cdr1：wmsam（seq id no.：10）、cdr2：gmkyrttpsvsadswky（seq id no.：11）、cdr3：dydmgqtweay（seq id no.：12）。

9、在一个抗mic蛋白纳米抗体的具体实例中，所述抗mic蛋白纳米抗体的fr1～fr4的氨基酸序列如下：

10、fr1：dvqlqesggglvqpggslrlscvgsgfsft（seq id no.：13）；

11、fr2：wyrqapgkerelva（seq id no.：14）；

12、fr3：rftiskdnnkntvylqmnnlkpedtavyycrr（seq id no.：15）；

13、fr4：wgqgtqvtvss（seq id no.：16）。

14、本发明的第二个方面，提供：

15、一种抗ulbp蛋白的纳米抗体，其cdr1～cdr3的氨基酸序列如下：

16、cdr1：lvsgmgg（seq id no.：17）、cdr2：eihwdwddkrynapslk（seq id no.：18）、cdr3：yldlmetpwysvmdqy（seq id no.：19）；或

17、cdr1：lltgmgv（seq id no.：20）、cdr2：fihwdgddkrynapglk（seq id no.：21）、cdr3：yldlmetpwysvmeqy（seq id no.：22）；或

18、cdr1：vptgmvg（seq id no.：23）、cdr2：fihwdwedkrynapslk（seq id no.：24）、cdr3：yldlmespwysvmdqy（seq id no.：25）；或

19、cdr1：lvtgmgg（seq id no.：26）、cdr2：afhwdwddkrynapsvk（seq id no.：27）、cdr3：yqdlmetpwysvmdqh（seq id no.：28）。

20、在一个抗ulbp蛋白纳米抗体的具体实例中，所述抗ulbp蛋白纳米抗体的fr1～fr4的氨基酸序列如下：

21、fr1：qvtlkesgpgilqpsqtlsltcsfsgfsls（seq id no.：29）；

22、fr2：wirqpsgkglewla（seq id no.：30）；

23、fr3：rltiskdtsnnqvflkiasvdttdtatyycvr（seq id no.：31）；

24、fr4：wgqgtsvtvss（seq id no.：32）。

25、本发明的第三个方面，提供：

26、一种抗mic蛋白和ulbp蛋白的二价纳米抗体，由本发明第一个方面所述的抗mic蛋白纳米抗体和本发明第二个方面所述的抗ulbp蛋白纳米抗体通过连接肽偶联得到。

27、在一个具体的二价纳米抗体的实例中，所述连接肽的氨基酸序列为(glyser)n、(gly2ser)n、(gly3ser)n或(gly4ser)n，n=1～5。

28、在一个二价纳米抗体的具体实例中，所述连接肽的氨基酸序列为：ggggsggggsggggs。

29、在一个二价纳米抗体的具体实例中，所述二价纳米抗体的氨基酸序列为：m-dvqlqesggglvqpggslrlscvgsgfsft-awsry-wyrqapgkerelva-gttwddtlkvyadsvkg-rftiskdnnkntvylqmnnlkpedtavyycrr-wygrtfdayn-wgqgtqvtvss-ggggsggggsggggs（seq id no.：33）-qvtlresgpgilqpsqtlsltcsfsgfsls-lltgmgv-wirqpsgkglewla-fihwdgddkrynapglk-rltiskdtsnnqvflkiatvdttdtatyycvr-yldlmetpwysvmeqy-wgqgtsatvss-hhhhhh。首端的m为起始密码子对应的氨基酸，尾端为his标签。

30、所述纳米抗体可用真核及原核表达，真核表达优选cho细胞，原核表达优选大肠杆菌。

31、本发明的第四个方面，提供：

32、编码本发明第一个方面所述的抗mic蛋白纳米抗体、本发明第二个方面所述的抗ulbp蛋白纳米抗体或本发明第三个方面所述二价纳米抗体的dna序列。

33、在一个dna序列的具体实例中，其核苷酸序列为： ccatggatgtgcagctgcaggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgtgggcagcggctttagctttaccgcgtggagccgctattggtatcgccaggcgccgggcaaagaacgcgaactggtggcgggcaccacctgggatgataccctgaaagtgtatgcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagcaaagataacaacaaaaacaccgtgtatctgcagatgaacaacctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgccgccgctggtatggccgcacctttgatgcgtataactggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagcggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggtggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccgggcattctgcagccgagccagaccctgagcctgacctgcagctttagcggctttagcctgagcctgctgaccggcatgggcgtgtggattcgccagccgagcggcaaaggcctggaatggctggcgtttattcattgggatggcgatgataaacgctataacgcgccgggcctgaaacgcctgaccattagcaaagataccagcaacaaccaggtgtttctgaaaattgcgaccgtggataccaccgataccgcgacctattattgcgtgcgctatctggatctgatggaaaccccgtggtatagcgtgatggaacagtattggggccagggcaccagcgcgaccgtgagcagccatcatcatcatcatcattaa ctcgag（seq id no.：34）。

34、本发明的第五个方面，提供：

35、一种免疫吸附剂，包括固相载体，所述固相载体上偶联有：

36、本发明第一个方面所述的抗mic蛋白纳米抗体；或

37、本发明第一个方面所述的抗mic蛋白纳米抗体和本发明第二个方面所述的抗ulbp蛋白纳米抗体；

38、或本发明第三个方面所述二价纳米抗体。

39、在一些免疫吸附剂的具体实例中，其用于结合nkg2d配体。

40、在一些免疫吸附剂的具体实例中，所述nkg2d配体包括mica、micb和ulbp分子。

41、在一些免疫吸附剂的具体实例中，所述免疫吸附剂主要用于治疗由可溶性的nkg2d配体引起的肿瘤抑制作用，相关肿瘤包括黑素瘤、肺癌、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌等。

42、在一些免疫吸附剂的具体实例中，所述固相载体选自壳聚糖微球、琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、树脂、纤维素微球中的至少一种。

43、在一些免疫吸附剂的具体实例中，采用nhs活化法进行偶联。

44、在一些免疫吸附剂的具体实例中，所述偶联的步骤如下：

45、s1) 二价纳米抗体溶液用ph=8.0～8.5含0.1m nahco3和0.5m nacl的偶联液b缓冲溶液进行透析2h；

46、s2) 取nhs预活化的填料用预冷的1mm hcl偶联溶液a进行冲洗，冲洗完成后加入0.5倍填料体积的偶联溶液a，然后再加入1.5倍填料体积的纳米抗体溶液，振荡孵育后加入2倍填料体积的封端液（0.1m tris-hcl，ph8.3）振荡封端，然后抽干；

47、s3) 往抽干后的填料中加入ph=8～9的0.1m tris-hcl与ph=3～6的0.2m醋酸交替洗涤，然后加入pbs溶液清洗填料，抽干，保存于20%乙醇中。

48、本发明的第六个方面，提供：

49、一种血液净化器械，其包括本发明第五个方面所述的免疫吸附剂。

50、在一些血液净化器械的具体实例中，其用于结合nkg2d配体。

51、在一些血液净化器械的具体实例中，所述nkg2d配体包括mica、micb和ulbp分子。

52、在一些血液净化器械的具体实例中，所述血液净化器械主要用于治疗由可溶性的nkg2d配体引起的肿瘤抑制作用，相关肿瘤包括黑素瘤、肺癌、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌等。

53、本发明的有益效果是：

54、本发明一些实例的抗mic蛋白的纳米抗体，对游离的可溶性mica、micb分子具有良好的结合力，可用于吸附去除肿瘤患者血液中游离的可溶性mica、micb分子。

55、本发明一些实例的二价纳米抗体，可以同时吸附肿瘤患者血液中游离的可溶性mica、micb和ulbp蛋白分子，因抗原抗体的结合力更强，所以相较于受体nkg2d合成的免疫吸附剂其对特定的mic蛋白及ulbp蛋白的清除效率更高。同时，广谱性更强，比单纯吸附mic蛋白的吸附剂应用范围更广，为癌症的免疫治疗提供了新的治疗方式。

56、本发明一些实例的免疫吸附剂和血液净化器械，可以通过血液净化的方式同时清除肿瘤患者血清中游离的可溶性mica、micb和ulbp分子，提高清除率，减少免疫逃逸作用，增强nk细胞的靶向杀伤作用。