检测细胞中DNA的方法与流程

本技术属于分子生物学领域，具体涉及一种检测细胞中dna的方法。

背景技术：

1、氨基酸的序列决定了蛋白三维结构，而三维结构决定蛋白质的功能。21世纪以来，研究人员发现在天然状态下没有稳定三维结构的蛋白质依然发挥重要的生物学功能，这得益于这类蛋白拥有一段无法折叠成稳定的结构的区域，被称为固有无序区域（intrinsically disordered regions，idrs）。

2、idrs的存在使得蛋白更容易形成液滴状，诱发相变生成和调控发生。idrs参与到信号传导、转录、rna加工和细胞周期调控等多个重要生物学过程中，近期研究发现，含有idrs的蛋白质参与下游基因表达调控。例如，转录因子在增强子区域通过其idrs区域介导凝析物的形成，驱动相分离以实现下游关键基因表达。报道显示，79%的癌症相关蛋白被证实具有idrs，但目前对针对这类蛋白质在全基因组基因调控中发挥的协调作用知之甚少，研究这类含有idrs的蛋白质与dna在染色质环境下的相互作用可以进一步了解基因表达及其调控模式，也可为下游相关癌症靶标药物的研发提供新的机遇。

3、近期发表于《自然—生物技术》杂志的dna相关无序蛋白质全基因组测序技术（disordered protein precipitation followed by dna sequencing，disp-seq）是一种不依赖抗体的、通过生物素化异恶唑（biotinylated isoxazole，b-isox）沉淀和下一代测序，研究dna-蛋白idrs的全基因组图的一种方法。该方法利用小分子化合物b-isox在低温条件下可与含有idrs蛋白质形成微晶体沉淀的特性，结合二代测序，测定能与这些含有idrs的蛋白质结合的相关dna片段的全基因组图谱，研究它们在基因调控程序中的作用。

4、然而，现有的disp-seq技术主要存在如下问题：

5、1、起始细胞量高，不适用于少量细胞实验

6、利用适当的酶切条件获得片段大小合适的dna-蛋白复合物是disp-seq实验成功的前提，然而目前disp-seq中使用的微球菌核酸酶micrococal nuclease（mnase），对细胞数量（百万级以上）有很高的要求。目前的disp-seq技术的起始量细胞为1000万，即单个样品需要至少千万级别的起始数目才可保证实验的可重复性和可比性，无法满足针对少量细胞群体的生物学问题，限制了其在一些稀有和珍贵的样本中的应用。

7、2、实验流程繁琐，所需时间长

8、目前的disp-seq技术经酶切等后续操作后，需进行繁琐且耗时的传统dna片段化、末端修复以及添加测序引物等一系列建库操作，通常由mnase介导的高通量测序技术往往需要2-3天的实验时间。disp-seq技术从样品制备到获得可供测序的样品，需历经细胞核提取（0.5h）-酶切（0.5h）-漂洗（0.5h）-dna-idr蛋白复合物富集（1h）-漂洗（0.5h）-dna-idr蛋白复合物洗脱（1h）-解交联（4h）-纯化（0.5h）-dna建库（2h）-pcr扩增（1h）-纯化（0.5h）-库检（1h）等长达12个小时以上的操作步骤，复杂的实验过程增加了样品制备的时间，增大了误差的概率。

9、3、文库制备具有偏好性，易造成关键信息丢失

10、研究指出，基因组的某些区域比其他区域对mnase消化更敏感，目前disp-seq技术中使用的mnase更偏好切割基因组中碱基at富集区域，具有明显的序列偏好性；此外，由于mnase与染色质结合后同时具有核酸外切酶及核酸内切酶活性，因此mnase更适用于探查核小体定位的分布，即更倾向获得与核小体定位相关的蛋白结合的dna信息，核小体之外蛋白结合的dna信息实验过程中则极容易被丢失，降低了测序数据的准确性。

技术实现思路

1、基于此，本技术一实施例提供一种检测细胞中dna相关无序蛋白全基因组的方法，能够准确并且精确获取细胞中dna相关无序蛋白全基因组。

2、一种检测细胞中dna的方法，包括：

3、对待测细胞进行裂解，取细胞核；

4、混合所述细胞核和带测序文库接头的tn5转座酶进行反应，制备第一混合物；

5、用无序蛋白富集所述第一混合物中的dna，收集所述dna，制备第二混合物；以及，

6、采用与所述测序文库接头匹配的引物扩增所述第二混合物，构建测序文库，测序分析，实现获取细胞中dna的检测。

7、在其中一个实施例中，所述文库接头包括接头1与接头2。

8、所述接头1的序列如seq id no.1所示，所述接头2的序列如seq id no.2所示。

9、在其中一个实施例中，所述带文库接头的tn5转座酶的制备过程包括：

10、将所述的接头1与接头2分别进行退火反应，得接头1’和接头2’；混合tn5转座酶、接头1’和接头2’，室温孵育，制备带文库接头的tn5转座酶。

11、在其中一个实施例中，tn5转座酶、接头1’与接头2’的摩尔比为（0.8~1.2）:（0.4~0.6）:（0.4~0.6）。

12、在其中一个实施例中，所述接头1的退火反应的反应体系包括：48mm~52mm的nacl、0.8mm~1.2mm的edta，180μm~220μm的me、180μm~220μm的接头1以及8mm~12mm,ph为7.4~7.6的tris缓冲体系；

13、所述接头2的退火反应的反应体系包括：48mm~52mm的nacl、0.8mm~1.2mm的edta，180μm~220μm的me、180μm~220μm的接头2以及8mm~12mm，ph为7.4~7.6的tris缓冲体系；

14、所述me的序列如seq id no.3所示。

15、在其中一个实施例中，所述接头1和所述接头2的退火反应的条件各自独立地包括：94℃~96℃，1.5min~2.5min；94ºc~96℃，7s~9s，-0.08℃~-0.12ºc，共690~710个循环。

16、在其中一个实施例中，富集第一混合物后还包括漂洗的步骤。

17、在其中一个实施例中，漂洗包括加入洗涤缓冲液。

18、所述洗涤缓冲液包括18mm~22mm的tris-hcl，ph为7.3~7.5、145mm~155mm的nacl、4mm~6mm的mgcl2、0.40v/v%~0.60v/v%的np-40、9v/v%~11v/v%的glycerol、48×~52×的pi、0.08mm~0.12 mm的pmsf、18mm~22 mm的beta-mercaptoethanol。

19、在其中一个实施例中，用无序蛋白富集第一混合物包括加入b-isox裂解缓冲液；

20、所述b-isox裂解缓冲液包括18mm~22mm的tris-hcl，ph为7.3~7.5、185mm~190mm的nacl、4mm~6mm的mgcl2、0.60v/v%~0.65v/v%的np-40、12v/v%~13v/v%的glycerol、48×~52×的pi、0.08mm~0.12 mm的pmsf、24mm~26 mm的beta-mercaptoethanol以及90μm~110μm的b-isox。

21、在其中一个实施例中洗脱并纯化包括：加入洗脱缓冲液后采用磁珠纯化。

22、在其中一个实施例中，所述洗脱缓冲液包括8mm~12mm的tris-hcl,ph为7.3~7.5、145mm~155 mm的nacl、0.08v/v%~0.12v/v%的sds和4mm~6 mm的dtt；

23、在其中一个实施例中，所述磁珠包括ampurexp磁珠、vahtsdna磁珠和spriselect磁珠中的一种或多种。

24、建库效率高，能实现少量细胞中的信息捕获：采用本技术的检测细胞中dna相关无序蛋白全基因组的方法，在tn5转座酶酶切时，能够直接将带有测序文库接头的序列链接在产物片段dna的两端，这一高效的引物连接过程使得含有接头连接在目标dna片段两端的效率大大提高，在实验流程上能够将实验时间极大缩短，通过简单的酶促反应实现dna片段化的同时插入测序接头，避免了后续繁琐传统的末端修复以及添加测序引物等步骤，从而在后面扩增过程中捕获了更多的信息量，极大提高了数据重复性。

25、数据重复性以及信息捕获效率更高：从数据重复度上讲，采用本技术的检测细胞中dna相关无序蛋白全基因组的方法，在tn5转座酶在酶切染色质片段时，不会酶切核小体形式的dna片段，而双端测序可以对dna片段的两端进行测序，使基因组重复区域的reads比对更加准确。利用本技术所提供的技术方案，能够在更少的细胞量中获得更多的peakcalling数，更特异的信号富集峰以及更低的非特异性背景，具有更高的准确性和精确性。