抗百日咳毒素的抗体及其应用的制作方法

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，具体涉及一种由百日咳毒素(pt)刺激产生的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、百日咳是小儿常见的急性呼吸道传染病，百日咳杆菌是本病的致病菌。百日咳的特征为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故有百日咳之称。本病通过飞沫传播，传染性极强。百日咳典型的临床症状为持续性阵发性咳嗽，带有吸气性尾声或呕吐，易合并肺炎和脑炎，是导致死亡的主要原因。

2、百日咳杆菌能够产生多种毒性因子，包括百日咳毒素、丝状血凝素(fha)和黏附素(prn)等。其中pt是主要致病因子，pt能诱发机体的持久免疫力，对防治百日咳具有非常重要的作用。同时，pt又具有多种生物活性，比如提高小鼠对组织胺和5-羟色胺的敏感性，抑制巨噬细胞功能，损伤呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽等等。

3、目前，对于无细胞百日咳联合疫苗中有效抗原(pt等)的鉴别实验，主要是通过酶联免疫吸附试验(elisa)，而具有高度特异性的抗pt单克隆抗体可以大大提高实验的准确性和可靠性。目前国内无细胞百日咳疫苗的主要定量检测方法是总蛋白定量，该方法只能对样品中所有蛋白成分总含量进行定量，因此不能监控各批在制产品中各种抗原的质量浓度和比例，造成产品批间差异较大、稳定性较差。目前在无细胞百日咳疫苗生产过程中国际上已趋向采用elisa准确定量其各单一抗原组分，并对其分离纯化进行定量监控。使用高度特异性的抗pt单克隆抗体采用elisa对于pt纯化各个步骤样品以及百日咳类疫苗成品中pt抗原含量进行检测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验成本；因此，本领域迫切需要开发具有上述优势的抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗百日咳毒素的抗体、其编码序列及其在预防或治疗中的应用，旨在用高纯度的抗pt单克隆抗体来进行百日咳疫苗各生产步骤以及成品中对于pt抗原含量的检测，该抗体具有良好特异性、稳定性，可以大大提高pt抗原含量检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验成本。

2、第一方面，本发明涉及一种抗百日咳毒素的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链包含轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中：

3、(1)所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seqid no:2所示，所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示；或

4、(2)所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别为seq id no:1-3经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与seq id no:1-3功能相同；或

5、(3)所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别与seq id no:1-3具有80％以上同一性；并且

6、(4)所述lcdr1的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述lcdr2的氨基酸序列如seqid no:5所示，所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示；或

7、(5)所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别为seq id no:4-6经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与seq id no:4-6功能相同；或

8、(6)所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别与seq id no:4-6具有80％以上同一性；

9、或者，

10、(1)所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seqid no:10所示，所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no:11所示；或

11、(2)所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别为seq id no:9-11经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与seq id no:9-11功能相同；或

12、(3)所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别与seq id no:9-11具有80％以上同一性；并且

13、(4)所述lcdr1的氨基酸序列如seq id no:12所示，所述lcdr2的氨基酸序列如seqid no:13所示，所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no:14所示；或

14、(5)所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别为seq id no:12-14经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与seq id no:12-14功能相同；或

15、(6)所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别与seq id no:12-14具有80％以上同一性。

16、在优选的实施方案中，重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示；重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示；重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示；轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:4所示；轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:5所示；轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示；

17、或者，

18、其中重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:9所示；重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:10所示；重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq idno:11所示；轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:12所示；轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:13所示；轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq idno:14所示。

19、在优选的实施方案中，所述抗体重链的氨基酸序列如seq id no:7所示；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列为seq id no:7经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与seq id no:7功能相同；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列与seq idno:7具有80％以上同一性；并且

20、所述抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no:8所示；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列为seq id no:8经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与seq id no:8功能相同；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列与seq id no:8具有80％以上同一性；

21、或者，

22、其中所述抗体重链的氨基酸序列如seq id no:15所示；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列为seq id no:15经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与seq id no:15功能相同；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列与seq id no:15具有80％以上同一性；并且

23、所述抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no:16所示；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列为seq id no:16经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与seq id no:16功能相同；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列与seq id no:16具有80％以上同一性。

24、在具体实施方案中，所述抗原结合片段包括fab、fab’、f(ab’)2、fv片段和/或单链抗体。

25、其中，fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

26、fab’是指包含了部分铰链区的fab片段。

27、f(ab’)2指的是fab’的二聚体。

28、fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

29、单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

30、在具体实施方案中，所述抗体为完整的抗体分子。

31、在一个实施方案中，本发明的抗体指包含两个抗原结合区及fc区的抗体；优选地，所述抗体具有功能性fc区。

32、第二方面，本发明涉及核酸分子，其编码根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

33、在优选的实施方案中，所述核酸分子为分离的dna。

34、第三方面，本发明涉及一种检测装置，包括根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，优选地所述装置用于检测百日咳毒素，优选地所述装置为试纸、试剂盒或芯片。

35、在优选的实施方案中，所述装置为elisa检测试剂盒，其包含包被抗体和检测抗体，其中所述包被抗体为根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，所述检测抗体为特异性识别百日咳毒素的抗体；

36、任选地，所述包被抗体和/或检测抗体经生物标记或化学标记，优选地经酶标记，更优选地经辣根过氧化物酶标记。

37、第四方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段以及可药用的载体。

38、第五方面，本发明涉及根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测百日咳毒素的装置中的用途；优选地，所述装置包括但不限于试纸、试剂盒或芯片。

39、第六方面，本发明涉及根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗由百日咳毒素引起的疾病的药物制剂中的用途；优选地，所述疾病是百日咳。

40、第七方面，本发明涉及根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在百日咳疫苗质检中的用途，优选地用于检测百日咳疫苗制备过程中或疫苗成品中百日咳毒素抗原的含量。

41、第八方面，本发明涉及一种检测生物学样品中百日咳毒素抗原的存在和/或量的方法，所述方法包括：

42、a)使生物学样品与根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第五方面所述的检测装置接触；和

43、b)检测所述抗体或其抗原结合片段与百日咳毒素之间复合物的形成和/或测定复合物的量；

44、优选地，其中所述生物学样品和百日咳毒素形成复合物与对照样品和百日咳毒素形成复合物之间的差异指示样品中百日咳毒素的存在和/或量。

45、本发明提供了一种全新的抗pt单克隆抗体，采用pt免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗pt单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。经纯化得到的单克隆抗体可特异性地识别pt抗原。将所得两个代表性单克隆抗体分别称之为抗体3d6和抗体3g5。经elisa实验表明，抗体3d6和抗体3g5具有良好的灵敏度及专属性，可用于pt抗原的检测。