琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qRT-PCR方法与流程

本发明公开了琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qrt-pcr方法，属于生物检测领域。

背景技术：

1、尼帕病毒病是最近20年新出现的传染病，为尼帕病毒(nipah virus，niv)所致，严重者出现急性脑炎综合征或肺综合征，致死率达40％～100％。由于尼帕病毒病的高死亡率、人兽共患性、可发生人—人传播、无特效药和疫苗，世界卫生组织在《研究和发展蓝图》的优先病原体清单中将尼帕病毒列为需要监测和制定大流行应对措施的8种最危险病原体之一。病毒核酸的快速检测对于早期发现感染病例至关重要。琅琊病毒(langya virus，layv)以山东省琅琊镇命名，是一种系统发育独特的人畜共患亨尼帕病毒。对家畜进行的血清调查中，山羊和狗的血清阳性率分别为2％和5％。在所检测的25种野生小型哺乳动物中，layv rna主要在鼩鼱中检测到(27％)，但尚未有人际传播的记录。在中国，layv被鉴定为与墨江病毒(mojiang virus，mojv)的系统发育关系为最密切的亨尼帕病毒属的新成员。wu等研究指出从黄胸大鼠身上采集的九个肛拭子样本中检测出三个mojv阳性，推测黄胸鼠属大鼠是mojv的天然宿主。在澳大利亚昆士兰州雪松林的飞狐群落中发现雪松病毒(cedarvirus，cedv)，为另一种亨尼帕病毒。

2、layv、mojv、niv和cedv都是负向单链rna病毒，均属于亨尼帕病毒属副粘病毒科。在副粘病毒科中，亨尼帕病毒属是唯一可造成人畜共患高致病性疾病的属类。亨尼帕病毒既可以在蝙蝠之间传播，也可以在溢出事件中传播给其他物种。除了一些关于利巴韦林和法匹拉韦对niv有抗病毒活性的报道外，目前还没有批准人类用于亨尼帕病毒的药物或疫苗。因此，至关重要的是监测方法的建立，以实现对病毒暴露风险及时、准确、全方位的管理，为突发事件的预警、预报、处置以及事后恢复等阶段的工作做好准备。如2018年niv爆发期间使用的监测方法，包括分离培养、血清学方法、分子生物学方法等，采用血清法诊断的缺陷在于，当基因序列有高度的同源性时，使用高免疫原性抗原，可以用来检测这两种病毒的抗体，但困难的是无法鉴别两者。病毒分离和中和方法也用于诊断，但仅限于bsl-4设施。二代测序是一种有助于有效鉴定病毒株的替代方法，但该方法在诊断和考虑费用时并不经常使用。最优选和极其敏感的诊断方法是pcr包括常规的逆转录pcr(rt-pcr)和巢式pcr，虽然实时荧光定量rt-pcr价格昂贵，但由于其极高的灵敏度，被广泛用于niv检测/诊断。关于雪松病毒的检测方法研究介绍较少，主要研究抗体及受体特异性检测(p基因)，也开发了针对p基因的taqman mgb检测方法，但未用临床样本进行检测。关于墨江病毒的检测方法研究介绍也较少，主要研究是g蛋白和f蛋白进入细胞的途径，开发了l基因的特异性巢式引物组，并用肛拭子或其他组织样本进行验证。关于琅琊病毒的检测方法研究介绍较少，主要研究是f蛋白的融合结构，现目前检测为宏基因组测序。可见，在现有技术中仍然没有一个系统的方法用于检测和区分尼帕病毒、琅琊病毒、墨江病毒、雪松病毒这四种病毒。

3、传统的检测方法包括病原分离培养法和免疫检测法。但这些方法操作流程繁琐，灵敏度低，检测时间长；因此，它们不能满足快速诊断的要求。有研究报道，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)检测具有高灵敏度和特异性，可以在疾病早期检测病毒，目前是各实验室最常用的检测方法。taqman荧光探针仅与目标序列结合，不受非特异性产物的影响。不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以在同一反应体系中使用不同荧光标记的探针，同时检测多个靶标，从而节省实验成本，大大缩短检测时间。多重qrt-pcr的反应原理、反应试剂和操作过程与传统pcr相似，而多重qrt-pcr可以同时检测或鉴定多种病原微生物、遗传疾病和癌症基因。此外，与传统pcr相比，多重qrt-pcr具有高效、高通量、简便、低成本、系统性强等优点。并且多重qrt-pcr检测灭活的临床样本只需在bsl-2实验室就可进行。

技术实现思路

1、本方法以实时荧光qrt-pcr为基础，分别设计检测4种病毒的特异性引物并进行组合优化，能够以1次检测对4种病毒进行区分，在节省了试剂耗材与标本用量的同时也缩短了确定病原体所需时间。为快速排查疑似感染人群提供参考信息，为相关疾病的鉴别诊断提供技术支持，适合省、市、县各级实验室开展。

2、本发明提供了一种多重qrt-pcr检测病毒的引物和探针组，用于检测亨尼帕病毒属。

3、在本发明的一种实施方式中，所述亨尼帕病毒属包括琅琊病毒(langya virus，layv)、墨江病毒(mojiang virus，mojv)、尼帕病毒(nipah virus，niv)和雪松病毒(cedarvirus，cedv)。

4、在本发明的一种实施方式中，用检测layv的引物如seq id no.1和2所述，探针如seq id no.3所示。

5、在本发明的一种实施方式中，用检测mojv)的引物如seq id no.4和5所述，探针如seq id no.6所示。

6、在本发明的一种实施方式中，用检测niv的引物如seq id no.7和8所述，探针如seq id no.9所示。

7、在本发明的一种实施方式中，用检测cedv的引物如seq id no.10和11所述，探针如seq id no.12所示。

8、在本发明的一种实施方式中，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团包括fam、hex、vic、rox或cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

9、在本发明的一种实施方式中，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为bhq1和bhq2。

10、进一步的，seq id no.3所示核苷酸序列与seq id no.9所示核苷酸序列采用淬灭基团bhq1修饰，seq id no.6所示核苷酸序列与seq id no.12所示核苷酸序列采用淬灭基团bhq2修饰。

11、本发明提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒中含有所述多重qrt-pcr检测病毒的引物和探针组。

12、在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有四种亨尼帕病毒的阳性对照和阴性对照。

13、在一种实施方式中，所述阳性对照分别为连接有layv、mojv、niv、cedv基因片段的质粒。

14、本发明提供一种检测四种亨尼帕病毒的方法，所述方法不以疾病的诊断为目的，所述方法为利用所述多重qrt-pcr检测病毒的引物和探针组或所述试剂盒进行四种亨尼帕病毒的检测，所述四种亨尼帕病毒为layv、mojv、niv、cedv。

15、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

16、s1、从样品中提取核酸；

17、s2、以s1提取的核酸为模板，利用所述多重qrt-pcr检测病毒的引物和探针组进行多重实时荧光定量pcr扩增反应；

18、s3、根据实时荧光定量pcr的荧光扩增信号判定样品中是否含有layv、mojv、niv、cedv。

19、在一种实施方式中，s2中所述实时荧光定量pcr的扩增体系为taq酶0.5μl、逆转录酶0.5μl、四种探针各0.25μl和四对上下游引物各0.5μl、pcrbuffer 12.5μl和核酸模板4μl。

20、在一种实施方式中，s2中所述实时荧光定量pcr的反应程序为45℃反转录5min，95℃预变性10s；95℃5s和60℃30s；40个扩增循环，60℃退火延伸。

21、有益效果：

22、副粘病毒科亨尼帕病毒属新出现的病毒对公共生物安全构成重大威胁，建立四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)检测方法对人畜共患传染病的早期预警至关重要。基于琅琊病毒(langya virus，layv)、墨江病毒(mojiang virus，mojv)、尼帕病毒(nipah virus，niv)和雪松病毒(cedarvirus，cedv)的全基因组序列，设计了相对保守区域的特异性引物和探针，建立了四重实时荧光qrt-pcr检测方法。本方法与其他病毒核酸无交叉反应。layv、mojv、niv和cedv的最佳线性检测范围为101～108copies/μl，下限为10copies/μl。layv、mojv、niv、cedv的3种不同dna浓度(104、105、106copies/μl)重复检测14次，具有良好的重复性。各浓度ct值的标准差<0.5，变异系数<3％。四重实时荧光qrt-pcr检测扩增效率>90％，相关系数>0.99。本研究建立的四重实时荧光qrt-pcr检测layv、mojv、niv和cedv的方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性。因此，可用于检测亨尼帕病毒及其他相关临床标本。