大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法与流程

本发明涉及大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法，用于大熊猫精液的添加剂，涉及一种外泌体的制备。

背景技术：

1、外泌体是一种细胞分泌的微囊泡，直径约30-150nm，包含蛋白、rnas、脂质和dna等；外泌体具有多种生物学功能，有研究发现外泌体对精液的冷冻效率有一定的促进作用，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，起到调节细胞状态与功能的作用；外泌体安全性好，不表达mhcⅰ或ⅱ类抗原，非自我复制，降低了医源性肿瘤形成的风险；利用外泌体来进行组织修复，可以避免产生免疫排斥反应、血管阻塞、突变成瘤的风险，安全性大大提高；

2、在猪精液研究中发现长期保存时，在冷藏保存猪精液时添加猪精浆外泌体可以显著提高精子活力、存活时间和质膜完整性，也可以增强精子抗氧化能力，降低脂质过氧化，而且与外泌体浓度呈正相关；将猪输卵管胞外囊泡和精子共孵育后，能够延长精子的存活时间；大鼠精液冷冻时添加大鼠间充质干细胞来源的囊泡，可以增加冻融精子的活力和抗氧化能力；在犬冻精过程中添加50μg/ml的脂肪间充质干细胞源外泌体后，能够提高冻融后精子活力、活率、膜完整性和顶体完整性；在犬精液冷冻保护过程中，首先培养犬脂肪源间充质干细胞，然后通过试剂盒提取培养液中外泌体，最终在冻存液中加入外泌体后对犬精子进行液氮冷冻；整体思路与本发明方法类似；

3、外泌体在细胞内，由多泡体分泌，其蛋白、dna和rna等组成和分泌其的细胞很类似；研究证明不同细胞来源的外泌体的蛋白组、脂质组不同，在对u87胶质母细胞瘤细胞、huh7肝癌细胞和人骨髓间充质干细胞3种不同的细胞来的外泌体分析中发现：胶质母细胞瘤细胞、肝癌细胞来源的外泌体蛋白组类似，和人骨髓间充质干细胞来源的外泌体差别较大，而肝癌细胞、人骨髓间充质干细胞来源的外泌体脂质组类似与胶质母细胞瘤细胞来源的外泌体差别大；

4、在成纤维和脂肪间充质干细胞来源的外泌体抗炎症对比实验中，发现抗炎因子il-10在脂肪间充质干细胞来源的外泌体组中升高，而il-1β、il-8、il-2、rantes和ifn-γ等促炎因子显著降低，说明不同细胞来源的外泌体作用效果不同。

5、专利申请号为202310182831.4的发明专利，公开了一种精子的冷冻保存和复苏方法，该专利公开了人精浆外泌体的分离收集、精子的冷冻保存、以及精子的复苏三个步骤，该技术可以解决人类精液的收集、保存和复苏的问题，但是该技术在人精浆外泌体的分离收集都是采用人类精液作为外泌体的原料，就是说：现有的方案将人体精液离心后1：1添加，需要额外采集精液，这在人类是可以的，但是大熊猫因物种特殊性，不可能采集大量精液用于外泌体的分离,因此该技术不适用于大熊猫需要的外泌体的制备；另外，现有的技术方案将精液离心后1：1添加，未明确外泌体浓度，所以，外泌体的浓度会因精液质量不同而产生变化。

6、大熊猫是全球生物多样性的旗舰物种，在很多方面都有价值：(1)外交形式的政治价值；(2)作为国家象征的文化价值；(3)在中国和全球范围内的保护价值；大熊猫的动物福利也越来越受到大家的关注，因此，大熊猫相关研究需要采用非损伤性的方式；而现有方案，都是其它物种的外泌体或类似物，直接应用于大熊猫精液保存，极易引入外物种基因，对大熊猫种群遗传有潜在威胁；本发明研究的是从脐带分离间充质干细胞进而获得外泌体，更加符合动物福利的要求，这是因为，不同物种来源、不同组织部位来源的间充质干细胞外泌体成分和生物学功能差异较大，使用条件也没有可比性，因此，本发明采用大熊猫脐带间充质干细胞来源的外泌体作为大熊猫精液的冷冻保护添加剂，更加符合大熊猫这一特殊物种遗传物质的保存与后续的使用的要求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：制备一种可用于大熊猫人工授精的大熊猫精液添加剂外泌体的制备方法，包括外泌体的制备、外泌体浓度筛选和精液冷冻方法。

2、本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：

3、1、所述外泌体的制备由以下步骤构成：

4、s1:用完全培养基(低糖dmem+10％ fbs+10ng/ml bfgf+1％(青霉素/链霉素)培养第4代的大熊猫脐带来源的间充质干细胞(uc_mscs)，融合度达80％时，弃去完全培养基，用pbs缓冲液清洗贴壁细胞；

5、s2:加入不含fbs的低糖dmem，培养48h后收集细胞上清；

6、s3:将收集到的100ml细胞上清进行4℃，300g，离心30min，以去除细胞；再以2000g，离心30min去除细胞碎片；

7、s4：将s3完成的上清液移至新的离心管，采用4℃，10000g的离心泵，离心45min去除较大的囊泡，然后用0.45μm滤膜过滤；

8、s5：收集过滤液，再以4℃，100000g，离心70min，去除上清；

9、s6:用10ml预冷的pbs缓冲液重悬后，再次以4℃，100000g，离心70min，去除上清并用150μl pbs重悬得到外泌体，在-80℃冰箱保存备用。

10、2、所述外泌体浓度筛选：

11、s1:精液采集后，取1×108个大熊猫精子，600g离心15min，用1ml inra96冷冻液重悬后，分为4等份置于4个2ml的离心管中；

12、s2:向每个离心管中添加外泌体，使四个离心管中的外泌体最终浓度分别为：0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，然后放置在4℃保存16h后，进行casa检测活力。

13、3、所述精液冷冻的方法：

14、s1:先取2×108个大熊猫精子，分为两等份，进行1000r/min离心。实验组用1mlinra96冷冻液(添加50ug外泌体)重悬；对照组用1ml inra96冷冻液重悬。

15、s2:然后用0.25ml细管进行精液灌装并封口，用泡沫盒盛装液氮，并将冷冻架放入泡沫盒中充分预冷。

16、预冷步骤如下：

17、第1步：将细管放置在距离液氮面约7.5cm处1分钟；

18、第2步：将细管放置在距离液氮面约2.5cm处1分钟，然后将细管投入液氮。

19、本发明的有益效果如下：

20、1、本发明中所使用的外泌体浓度为50ug/ml，经实验表明，该浓度为大熊猫精液冷冻保护的最佳浓度。

21、2、目前大熊猫精液冷冻过程添加的冷冻液不含有大熊猫自身分泌的生物活性物质，本发明在精液冷冻过程中添加外泌体，其内包含蛋白、rnas、脂质和dna等生物活性物质，对大熊猫精子的冷冻保护效果更好，更安全。

22、3、这种物质首次应用于大熊猫精液的冷冻保存，对于大熊猫遗传物质的高效保存，和实际生产具有很大的实用价值。

23、4、本发明在精液冷冻液中添加外泌体，通过反复验证和多次实验证明，该物质可以显著提高大熊猫冻精的顶体完整率。

24、5、这种物质首次应用于大熊猫精液的冷冻保存，优化了大熊猫精液冷冻保护液，进一步提高了大熊猫冻精质量，为大熊猫繁殖生产工作提供了技术支持；

25、6、本发明所使用的外泌体是由脐带间充质干细胞培养液分离得到，与现在技术相比，不用额外采集大熊猫精液提取外泌体，对于大熊猫更加适用。

26、7、经过研究证明，本发明对外泌体使用的浓度明确了外泌体的添加浓度，实验的重复性更好。

27、综上，本发明所用到的外泌体，其获取方式为非损伤性的，不会对大熊猫造成伤害，更加符合动物福利的要求。