高产比卡菌素的菌株及其应用

本发明涉及生物合成领域，特别涉及高产比卡菌素的菌株及其应用。

背景技术：

1、比卡菌素是一种红色四环类的聚酮天然产物，作为次级代谢产物，比卡菌素虽然在原生产宿主的作用并不清楚，但已被发现具有多种生物活性，且没有报道发现比卡菌素能像黄曲霉毒素、伏马菌素等一些真菌毒素引起人类的健康疾病，具有抗线虫、抗真菌和细菌、抗氧化活性等功能，在医药、农业、林业等方面均展示出了较强的应用潜力。

2、目前为止，比卡菌素多是由链孢种属菌株生产，除此之外仅在有限的其他真菌种发现了比卡菌素的合成。同时比卡菌素的异源合成报道较少，直到2020年，zhao等解析了比卡菌素的合成路径，并在酿酒酵母种首次实现了比卡菌素的异源合成。目前，对于比卡菌素在酵母中的异源表达调控还需更加深入地探索，通过理性设计的方式构建高产比卡菌素酵母菌株并不断进行优化的方式仍需较长时间的研究与探索。

3、现有比较常用的解决方法是采用一些非理性手段来制备高产比卡菌素的菌株。例如：以合成型酿酒酵母为底盘菌株利用scramble提升细胞工厂产物产量；将合成型酵母基因组重排技术与其他的诱变手段进行正交结合，以扩大基因突变库的范围，在较短的时间内筛选出更具优势的柔性底盘菌株。如对酿酒酵母采用合成型酵母基因组重排技术(scramble)与artp诱变相结合的方法，相对于单一诱变技术可以产生更多种类及更大范围的突变。该方法的步骤大致为：先构建具有合成型染色体且生产相应产物的酵母菌株，随后利用等离子体诱变结合scramble同时对此酵母菌株进行连续30天的诱变，最终通过筛选获得高产的诱变菌株。

4、“以合成型酿酒酵母为底盘菌株利用scramble提升细胞工厂产物产量”中因仅能在合成型染色体中产生结构变异，所涉及基因结构变异的染色体条数有限，能够发生重排的事件种类有限，因此重排库范围较小，存在筛选较优目标菌株时间较长、效率较低等缺点。

5、“等离子体诱变结合scramble同时诱变提升细胞工厂产物产量”中因需使用到artp诱变仪器，因此此方法成本较高；artp诱变仅针对调节细胞全局代谢的小尺度dna突变(单个碱基突变)，scramble仅针对数量较少的合成型染色体之间的结构变异，因此此方法无法实现在细胞全局层面发生大尺度的dna结构变异。

6、因此，提供一种高产比卡菌素的菌株具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了高产比卡菌素的菌株及在制备比卡菌素中的其应用。本发明在杂合二倍体合成型酵母中将链交换介导的多条染色体重排技术与scramble结合，相对于现有技术实现了在细胞全局的层面(所有染色体中)发生大尺度的dna结构变异，获得比卡菌素产量显著提高的酵母菌株ywy179。本发明将比卡菌素产量由9.66mg/l提升至133.62mg/l，提升13.82倍。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了染色体链交换介导的基因组重排和合成型酵母基因组重排在酵母中提升代谢产物中的应用；

4、所述染色体链交换介导的基因组重排和合成型酵母基因组重排包括：取酵母进行合成型酵母基因组重排，筛选获得所述代谢产物的产量提升的菌株，进行染色体链交换介导的基因组重排，获得高产代谢产物菌株，取所述高产代谢产物菌株发酵获得所述代谢产物。

5、在本发明的一些具体实施方案中，所述代谢产物包括次级代谢产物；

6、所述次级代谢产物包括比卡菌素。

7、本发明还提供了制备高产比卡菌素酵母菌株的方法，包括如下步骤：

8、取酵母进行合成型酵母基因组重排，筛选获得所述代谢产物的产量提升的菌株，进行染色体链交换介导的基因组重排，获得所述高产比卡菌素酵母菌株，取所述高产比卡菌素酵母菌株进行发酵验证。

9、在本发明的一些具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：

10、将第五号、第十号染色体替换为合成型染色体的酿酒酵母by4741，构建可以发生重排的产比卡菌素菌株；

11、将所述可以发生重排的产比卡菌素酵母菌株与y12野生型酵母菌株杂交为二倍体菌株；

12、对所述二倍体菌株进行合成型酵母基因组重排(scramble)诱变；

13、筛选所述合成型酵母基因组重排(scramble)后产量得到提升的优势菌株，进行发酵验证；

14、对重排后产量提升的底盘细胞进行生孢、拆孢，使其发生染色体链交换介导的基因组重排；

15、筛选所述染色体链交换介导的基因组重排后产量得到提升的优势菌株并进行发酵验证。

16、在本发明的一些具体实施方案中，所述将第五号、第十号染色体替换为合成型染色体的酿酒酵母by4741，构建可以发生重排的产比卡菌素菌株具体包括：将基因bik2，bik3，bik1，bik6，ppt，npga以leu为标签，通过can位点整合至所述第五号染色体的合成型染色体；开启scramble使用质粒gal-cre-ura质粒，将该质粒通过醋酸锂法转化到合成型v号和x号染色体酿酒酵母体内，转化后采用sc-ura-leu固体板进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后，得到所述可以发生重排的产比卡菌素菌株；

17、所述sc-ura-leu固体板包括合成酵母氮源ynb 6.7g/l，葡萄糖20g/l，缺尿嘧啶、亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/l，2％的琼脂粉。

18、在本发明的一些具体实施方案中，将所述可以发生重排的产比卡菌素酵母菌株与y12野生型酵母菌株杂交为二倍体菌株具体包括：分别取所述可以发生重排的产比卡菌素菌株与y12野生型酵母菌株单菌落至2ml ypd液体培养基中培养12-14h，将所述可以发生重排的产比卡菌素酵母菌株与所述y12野生型酵母菌株的菌液以初始od＝0.2转接至同一管ypd液体培养基中培养6h，4000rpm离心2min水洗两遍，涂至sc-ura-leu-his固体板进行筛选，得到的交配后菌株通过分纯培养后，得到所述二倍体菌株；

19、所述ypd液体培养基包括葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l；

20、所述sc-ura-leu-his固体板包括合成酵母氮源ynb 6.7g/l，葡萄糖20g/l，缺尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸的混合氨基酸粉末2g/l，2％的琼脂粉。

21、在本发明的一些具体实施方案中，所述对所述二倍体菌株进行合成型酵母基因组重排(scramble)诱变具体包括：取所述二倍体菌株在sc-ura-leu-his液体培养基过夜培养，隔天4000rpm离心2min，用ddh2o洗涤，以od＝0.5接入sg-ura-leu-his液体培养基；以1μl/1ml加入5μm雌激素，开启scramble，温度控制在30℃，摇床转速控制在250rpm，时间为6h；4000rpm离心2min，用ddh2o洗涤，涂布于sg-leu-his平板上，30℃培养2天，计数并观察菌落形态和颜色。

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述筛选所述合成型酵母基因组重排(scramble)后产量得到提升的优势菌株，进行发酵验证具体包括：选取重排后涂布于平板上颜色较深的单菌落，分纯培养，取单菌落于sc-leu-his液体培养基，30℃，250rpm培养14-16h，ddh2o洗涤，以初始od＝0.2转接至sg-leu-his培养基，30℃，250rpm发酵培养96h，取发酵液进行比卡菌素的产量测定，筛选获得产量提升的优势菌株。

23、在本发明的一些具体实施方案中，所述对重排后产量提升的底盘细胞进行生孢、拆孢，使其发生染色体链交换介导的基因组重排具体包括：取所述产量提升的优势菌株于所述ypd液体培养基过夜培养，隔天4000rpm离心2min，用ddh2o洗涤，以初始od＝0.5转接至生孢培养基中，25℃培养3-7天进行生孢；取生孢液进行拆孢：4000rpm离心2min，用ddh2o洗涤，55℃水浴50分钟，加破壁酶在37℃水浴30分钟，4000rpm离心2min，用ddh2o洗涤，涂布至ypg平板上，30℃培养3天，计数并观察菌落形态和颜色；

24、以3ml体系计，所述生孢培养基包括300μl的10×生孢液、300μl的10×氨基酸母液、余量为ddh2o；

25、所述ypg平板包括半乳糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，2％的琼脂粉。

26、在本发明的一些具体实施方案中，所述筛选所述染色体链交换介导的基因组重排后产量得到提升的优势菌株并进行发酵验证具体包括：取所述拆孢后涂布于平板上颜色较深的单菌落，分纯培养，取单菌落于所述sc-leu-his液体培养基，30℃，250rpm培养14-16h，用ddh2o洗涤，以初始od＝0.2转接至所述sg-leu-his培养基，30℃，250rpm发酵培养96h，取发酵液进行比卡菌素的产量测定，筛选获得所述高产比卡菌素酵母菌株。

27、本发明还提供了所述方法制得的酵母菌株。

28、本发明还提供了高产比卡菌素的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为cgmcc no.28196；

29、所述酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的使用形式包括活菌、灭活菌体、发酵液、外泌体或代谢产物中的一种或多种。

30、本发明还提供了微生物制剂，其包括所述酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

31、本发明还提供了所述酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、所述微生物制剂在制备比卡菌素中的应用。

32、本发明还提供了发酵方法，基于以下任意项进行发酵：

33、(i)、所述库德毕赤酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)；和/或

34、(ii)、所述微生物制剂。

35、本发明还提供了所述发酵方法制得的发酵制品；

36、所述发酵制品包括比卡菌素。

37、本发明包括但不限于取得了如下有益效果：

38、本发明在杂合二倍体合成型酵母中将链交换介导的多条染色体重排技术与scramble结合，相对于现有技术实现了在细胞全局的层面(所有染色体中)发生大尺度的dna结构变异，获得比卡菌素产量显著提高的酵母菌株。

39、生物保藏说明

40、生物材料：ywy179，分类命名：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，于2023年08月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.28196。