一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法

本发明涉及酶工程，具体涉及一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法。

背景技术：

1、脑卒中是全球第二大致死性疾病，对社会、政府和家庭都带来了巨大负担。中国是脑卒中的高发国家，每年有大约1300万脑卒中患者，新增病例约250万。其中，缺血性脑卒中占了总病例的大部分，年复发率高达17.7％。急性期的治疗对患者的康复至关重要，但目前缺乏确切有效的药物治疗。治疗缺血性脑卒中急性期的目标是改善脑血循环和神经保护，以减少神经细胞损伤和提高生活质量。治疗方法包括溶栓、抗血小板、抗凝、降纤等药物和血管内治疗。

2、糖苷类化合物在自然界中广泛存在，具备多种生物活性。特定结构的糖苷类化合物，包括其互变异构体、光学异构体、溶剂化合物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、前体药物或衍生物，具有预防和/或治疗缺血性脑血管疾病的潜力。这些化合物可用于干预与血管壁病变、血液成分变化和/或血流动力学变化相关的脑组织缺血的早期到晚期的各种症状和/或病理变化。研究发现，糖苷类化合物shpl-49(结构下图所示)通过对造成缺血级联反应的兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎症反应等多通路的调控，发挥神经保护作用，该药目前已获得nmpa和fda的临床试验许可。

3、

4、目前化学合成糖苷类化合物的主要方法有：(1)koenigs-knorr苷化反应，使用α-卤代糖在碳酸银的作用下，与醇发生取代反应制备糖苷，该方法首先要合成糖基卤代物，并且使用昂贵的银试剂，这是最为常见的一种合成方法。(2)schmidt三氯酰亚胺苷化反应，该方法使用三氯乙腈与糖基半缩醛在碱性条件下加成得到三氯乙酰亚胺酯，然后在路易斯酸催化下与醇或酚反应生产糖苷。该方法使用了3类致癌物质三氯乙腈以及反应过程中生产基因毒性副产物三氯乙酰胺。(3)kahne苷化反应，该方法使用糖基亚砜经过三氟甲磺酸酐的活化，与醇、酚反应得到相应的糖苷化合物，该反应使用-30～-78℃的温度，条件较为苛刻。(3)其他糖苷合成方法，其他的糖苷化方法还有相转移催化法、三氟乙酸酯法等，都是经典方法的改进，但也都存在一些问题或者局限性。因此，现有技术中在如何高选择性、高效的、更经济、更绿色环保的合成制备shpl-49仍然具有较多的难点与挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低、适合工业大规模生产。

2、本发明的第一方面是提供一种糖基转移酶突变体，将seq id no.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸得到糖基转移酶突变体，所述的糖基转移酶突变体的序列如seq id no:2所示。

3、本发明的第二方面是提供编码前述的糖基转移酶突变体的核酸分子或表达前述的糖基转移酶突变体的宿主细胞或包含前述的糖基转移酶突变体的催化剂。该催化剂可以为表达前述的糖基转移酶突变体的宿主细胞(基因工程菌)。

4、本发明的第三方面是提供前述的一种糖基转移酶突变体在催化合成急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49中的应用。

5、本发明的第四方面是提供一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，采用酶催化体系催化急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的合成；所述酶催化体系包括前述的糖基转移酶突变体。

6、优选的，所述的酶催化体系还包括蔗糖合酶；蔗糖合酶的序列如seq id no:3所示。

7、所述方法包括以下步骤：以4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇作为原料，添加蔗糖和udp，糖基转移酶突变体用于将udp-葡萄糖的葡萄糖基转移到4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇的醇羟基上，蔗糖合酶则用于将udp再生为udp-葡萄糖。具体地，在udp存在的条件下，蔗糖由蔗糖合酶催化生成葡萄糖、果糖和udp-葡萄糖，生成的udp-葡萄糖再次参与shpl-49的合成。

8、优选的，首先加入udp启动催化反应，酶组合中糖基转移酶突变体和蔗糖合酶来源于同一宿主细胞的细胞悬液或破胞粗酶液，或者糖基转移酶突变体和蔗糖合酶单表达菌株的细胞悬液混合液或破胞粗酶液混合液。

9、优选的，将糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因构建于同一个表达质粒上，导入宿主细胞，构建基因工程菌，更为优选的，表达质粒为pcdfduet-1，宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

10、进一步的，所述基因工程菌发酵时采用补料分批发酵方法，在基础培养基被消耗完全后，通过向发酵液补加补料培养基来使基因工程菌细胞密度得以继续增加，待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到od600＝20～40时，向发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束，细胞浓度达到od600＝200～300。

11、优选的，在酶催化体系中加入所述基因工程菌，催化反应过程中添加的原料4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇，反应体系中原料的浓度为5～50mm。

12、优选的，酶催化体系中，细胞浓度为10～30g/l，ph值为7.0～9.0，反应温度为20～50℃，udp的添加浓度为0.1mm～0.5mm，蔗糖的添加浓度为50mm～500mm，dmso浓度(体积分数)为1％-10％；所述的细胞为前述的基因工程菌。

13、本发明具有的有益效果：本发明提供的糖基转移酶突变体及用于生产shpl-49的方法，所产生的副产物易去除，无需复杂的分离工艺或不需要额外的分离工艺，简化了产品的后处理工艺；滴度能够达到6.5g/l，收率达到95.0％，时空产率325.0mg/l/h，充分利用了酶的催化活性，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，因此适合shpl-49新药的大规模生产。

技术特征：

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，将seq id no.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸得到糖基转移酶突变体，所述的糖基转移酶突变体的序列如seq id no:2所示。

2.编码权利要求1所述的糖基转移酶突变体的核酸分子或表达权利要求1所述的糖基转移酶突变体的宿主细胞或包含权利要求1所述的糖基转移酶突变体的催化剂。

3.权利要求1所述的一种糖基转移酶突变体在催化合成急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49中的应用。

4.一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，采用酶催化体系催化急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的合成；所述酶催化体系包括权利要求1所述的糖基转移酶突变体。

5.根据权利要求4所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，所述的酶催化体系还包括蔗糖合酶；蔗糖合酶的序列如seq id no:3所示。

6.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇作为原料，添加蔗糖和udp，糖基转移酶突变体用于将udp-葡萄糖的葡萄糖基转移到4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇的醇羟基上，蔗糖合酶则用于将udp再生为udp-葡萄糖。

7.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因构建于同一个表达质粒上，导入宿主细胞，构建基因工程菌。

8.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，所述基因工程菌发酵时采用补料分批发酵方法，在基础培养基被消耗完全后，通过向发酵液补加补料培养基来使基因工程菌细胞密度得以继续增加，待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到od600＝20～40时，向发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束，细胞浓度达到od600＝200～300。

9.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，在酶催化体系中加入所述基因工程菌，催化反应过程中添加的原料4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇，反应体系中原料的浓度为5～50mm。

10.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法，其特征在于，酶催化体系中，细胞浓度为10～30g/l，ph值为7.0～9.0，反应温度为20～50℃，udp的添加浓度为0.1mm～0.5mm，蔗糖的添加浓度为50mm～500mm，dmso浓度为1％-10％；所述的细胞为基因工程菌。

技术总结
本发明涉及一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL‑49的方法。该方法以4‑(4‑甲氧苯基)‑1‑丁醇为原料，经酶催化体系催化获得SHPL‑49。所述酶催化体系包括糖基转移酶突变体和蔗糖合酶。所述糖基转移酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸，其比酶活是野生型的3.37倍。采用本发明所述方法，可实现一步法合成SHPL‑49，滴度能够达到6.5g/L，转化率达到95.0％，时空产率325.0mg/L/h。该方法合成工艺步骤短、产物构型单一、转化率高、生产操作简单、设备要求低、绿色环保，在SHPL‑49新药的开发上有较大的前景。

技术研发人员：李国四,尹新坚,易善勇,洪亮,赵漫丽,韩邦兴
受保护的技术使用者：皖西学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24