一种靶向敲除STAT1基因的sgRNA、猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，尤其涉及一种靶向敲除stat1基因的sgrna、猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、基于原核生物的获得性免疫系统研发出的crispr-cas9技术包含两种重要的成分，一种是行使dna双链切割功能的cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgrna(shortguided rna)。当细胞内同时表达sgrna和cas9蛋白时，cas9蛋白通过与sgrna结合，靶向到目的dna序列上发挥dna双链切割的功能。作为导向的sgrna设计不合理会使cas9将靶点同源序列误认为靶点，使得非靶位点被编辑，造成脱靶。因此，sgrna脱靶是影响crispr/cas敲除效率低的主要原因，因此寻找特异性好、高效的靶点是技术成功的关键。

2、stat1(signal transducers and activators oftranscriptionare 1)是位于2号染色体的基因，这个基因编码的蛋白质是stat蛋白家族的成员。stat1可被ifnα、ifnγ、表皮生长因子、pdgf和il6等多种配体激活。通过基因敲除小鼠模型等方法，研究发现stat1缺失，不能传递ifn信号，不能产生ifnα，只能产生低水平量的ifnγ。stat1-stat2联合缺陷会导致女性不孕，体型变小，脾脏增大。目前对stat1基因的研究大部分是利用抑制剂发掘其在人和小鼠中的作用，对猪源stat1功能研究鲜有报道，而且药物阻断的特异性和有效性很难保障，不能很好的解释基因功能，也存在一定的风险性。

3、3d4/21细胞是猪肺泡巨噬细胞系，一般用于免疫、感染等方面的研究。由于其对刺激条件的敏感性及产生的不同极化状态，它们可以介导促炎因子(ifnγ、tnfα、il-6)或者抗炎因子(il-10、il-4、tgfβ1)的产生。其细胞内环境的复杂性远远大于体细胞，细胞的染色质结构、增殖能力和修复机制也与体细胞不同，更容易造成脱靶、沉默效率低、干扰不彻底。目前也尚无优秀的敲除stat1的免疫细胞模型，造成研究stat1在免疫细胞中发挥作用机理的局限性。并且目前现有技术的抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默stat1基因表达，因此有必要研制一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的猪stat1缺失免疫细胞株，为深入研究stat1在猪瘟感染致病机制中的作用奠定基础。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效敲除免疫细胞内stat1基因的sgrna、猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法和应用，以解决免疫细胞中复杂的细胞内环境对敲除效率的影响以及现有技术中sgrna脱靶、crispr/cas敲除效率低以及沉默不彻底或无法沉默stat1基因表达等问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向敲除stat1基因的sgrna，所述sgrna的正义链如seq idno.1所示，反义链如seq id no.2所示。

4、本发明还提供了一种靶向敲除stat1基因的重组载体，所述重组载体包括px459载体和靶向敲除stat1基因的sgrna。

5、本发明还提供了一种敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，包括以下步骤：

6、1)将seq id no.1所示的正义链和seq id no.2所示的反义链退火成双链，与经过bbsi酶切的px459载体连接，获得含有sgrna的表达载体px459-stat1；

7、2)将所述含有sgrna的表达载体px459-stat1转染至猪肺泡巨噬细胞培养，筛选得到敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系。

8、优选的，所述猪肺泡巨噬细胞转染前的汇合度为70％-80％。

9、优选的，所述筛选的方法包括以下步骤：将转染后的猪肺泡巨噬细胞进行培养、消化和传代后进行筛选；所述筛选的溶剂为嘌呤霉素，所述嘌呤霉素的浓度为1-3μg/ml。

10、优选的，所述转染的试剂为lip2000脂质体。

11、本发明还提供了所述的构建方法得到的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系。

12、本发明还提供了所述的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系在stat1基因猪瘟感染致病机制研究中的应用。

13、本发明还提供了一种所述的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系在制备stat1靶点药物中的应用。

14、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

15、1、本发明首次得到stat1基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系，利用crispr-cas9系统从猪肺泡巨噬细胞中敲除stat1基因，有效避免了免疫细胞中复杂的细胞内环境、细胞的染色质结构、增殖能力和修复机制对敲除效率的影响以及抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点，敲除效果更加彻底，适用于对stat1缺失的猪肺泡巨噬细胞进行更加深入的研究，填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价值。

16、2、本发明通过向猪肺泡巨噬细胞转染px459-stat1载体达到stat1基因敲除的目的，可提高基因敲除效率和特异性。crispr-cas9基因编辑技术可在不引入任何外源基因的情况下进行基因修饰，首次获得的stat1基因敲除免疫细胞系(即stat1基因敲除的肺泡巨噬细胞系)可作为体外研究猪瘟病毒致病机制和stat1蛋白在免疫细胞中功能的新型模型，同时为深入挖掘stat1基因在猪瘟病毒复制与转录过程中的作用研究提供基础。

技术特征：

1.一种靶向敲除stat1基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的正义链如seq id no.1所示，反义链如seq id no.2所示。

2.一种靶向敲除stat1基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括px459载体和权利要求1所述的靶向敲除stat1基因的sgrna。

3.一种敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述猪肺泡巨噬细胞转染前的汇合度为70％-80％。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述筛选的方法包括以下步骤：将转染后的猪肺泡巨噬细胞进行培养、消化和传代后进行筛选；所述筛选的溶剂为嘌呤霉素，所述嘌呤霉素的浓度为1-3μg/ml。

6.根据权利要求3或5所述的构建方法，其特征在于，所述转染的试剂为lip2000脂质体。

7.权利要求3-6任意一项所述的构建方法得到的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系。

8.权利要求7所述的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系在stat1基因猪瘟感染致病机制研究中的应用。

9.权利要求7所述的敲除stat1基因的猪肺泡巨噬细胞系在制备stat1靶点药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种靶向敲除STAT1基因的sgRNA(short guided RNA)、猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向敲除STAT1基因的sgRNA，所述sgRNA的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示。本发明的基因编辑技术能够有效减少相对于体细胞来说更为复杂的细胞内环境对敲除效率的影响。本发明通过优化sgRNA设计，向猪肺泡巨噬细胞转染PX459‑STAT1载体，优化转染体系，首次获得猪STAT1基因敲除的单克隆免疫细胞系，STAT1基因敲除效率达到81.1％，显著提高基因敲除效率和特异性。本发明的细胞系可作为猪抗病研究STAT1靶点的新型模型。

技术研发人员：罗廷荣,张丽媛,李晓宁,梁东立
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24