本发明涉及生物,尤其涉及一种靶向敲除stat1基因的sgrna和敲除stat1基因的猪肾细胞系及其应用。
背景技术:
1、crispr/cas是一种细菌防御入侵的适应性免疫系统,它识别来自噬菌体或质粒的入侵核酸,并通过cas9核酸酶切割rna或dna以消除感染。crispr/cas9是一种简单、快速的工具,可以对各种物种和细胞类型的内源基因进行高效修饰。sgrna(shortguided rna)是crispr/cas9系统的重要组成部分,由crispr衍生rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)两部分组成。部分crrna序列与tracrrna同源,crrna可以通过碱基配对与tracrrna结合形成tracrrna/crrna复合物。该复合体引导cas9核酸酶定位到待编辑的dna序列附近。cas9核酸酶作为一种rna导向的dsrna结合蛋白,是已知的第一个能够将rna、dna和蛋白质共定位的统一因子,显示出巨大的创造潜力。crispr/cas9系统已成功应用于多种物种,包括斑马鱼、小鼠和大鼠。此外,该技术对动物物种没有限制,在大豆、烟草、水稻、小麦等植物基因改造方面也取得了突破。然而,sgrna脱靶是影响crispr/cas敲除效率低的主要原因,因此寻找特异性好、高效的靶点是技术成功的关键。
2、stat1(signal transducers and activators of transcriptionare 1)作为stats家族的重要成员,通常由免疫细胞中i型ifn诱导。stat的生物学功能可以在细胞因子的应答中发挥作用,也可以调节生长因子的激活。通过基因敲除小鼠模型等方法,研究发现stat1缺失,不能传递ifn信号,不能产生ifnα,只能产生低水平量的ifnγ。stat1-stat2联合缺陷会导致女性不孕,体型变小,脾脏增大。目前对stat1基因的研究大部分是利用抑制剂发掘其在人和小鼠中的作用,对猪源stat1功能研究鲜有报道,而且药物阻断的特异性和有效性很难保障,不能很好的解释基因功能,也存在一定的风险性。并且目前现有技术的抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默stat1基因表达,因此有必要研制一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的猪stat1缺失细胞株,为深入研究stat1在猪瘟感染致病机制中的作用奠定基础。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种高效、易操作、重复性强的靶向敲除stat1基因的sgrna,解决了现有技术中抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的问题,同时首次获得了stat1基因缺失猪肾细胞株系,是理想的stat1基因敲除的pk-15细胞模型,为深入研究stat1蛋白功能和在猪瘟病毒感染致病机制中的作用奠定基础。
2、为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
3、本发明提供一种靶向敲除stat1基因的sgrna,所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。
4、本发明还提供了所述的sgrna在敲除stat1基因中的应用。
5、本发明还提供了一种含有所述sgrna的表达盒。
6、本发明还提供了一种含有所述sgrna的表达载体。
7、本发明还提供了所述表达载体的构建方法,包括以下步骤:
8、(1)在seq id no.1的5'端加上核苷酸序列为cacc的酶切位点和一个g,得到seqid no.3;
9、(2)在seq id no.2的5'端加上核苷酸序列为aaac的酶切位点,3'端加上c,得到seq id no.4;
10、(3)将seq id no.3和seq id no.4退火,形成双链dna分子;
11、(4)将px459载体酶切后与双链dna分子进行连接,得到表达载体px459-stat1。
12、本发明还提供了所述sgrna在构建stat1基因缺失细胞株系中的应用。
13、本发明还提供了所述stat1基因缺失细胞株系的构建方法,包括如下步骤:培养细胞至70~80%融合度时,将含有表达载体px459-stat1的混合液转染进细胞中并培养。
14、作为优选,所述培养的温度为35~39℃,培养的时间为12~16h。
15、本发明还提供了一种stat1基因缺失细胞株系。
16、本发明还提供了一种用于stat1基因敲除试剂盒,包括如下(1)~(4)中的任意一种:
17、(1)权利要求1所述的sgrna的核苷酸序列;
18、(2)权利要求3所述的表达盒;
19、(3)权利要求4所述的表达载体;
20、(4)权利要求9所述的stat1基因缺失细胞株系。
21、本发明提供了一种高效、特异性强、操作简单的靶向敲除stat1基因的sgrna及其应用。所述敲除stat1基因的sgrna的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示,stat1基因敲除效率达到82.4%。本发明首次得到stat1基因敲除的猪肾细胞系,利用crispr-cas9系统从猪肾细胞中敲除stat1基因,有效改进了抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点,敲除效果更加彻底。本发明在不引入任何外源基因的情况下进行基因修饰,获得的基因敲除细胞系可作为体外研究猪瘟病毒致病机制的模型,同时为深入挖掘stat1基因在猪瘟病毒复制与转录过程中的作用研究提供基础。
1.一种靶向敲除stat1基因的sgrna,其特征在于,所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的sgrna在敲除stat1基因中的应用。
3.一种含有权利要求1所述sgrna的表达盒。
4.一种含有权利要求1所述sgrna的表达载体。
5.一种权利要求4所述表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
6.权利要求1所述sgrna在构建stat1基因缺失细胞株系中的应用。
7.一种stat1基因缺失细胞株系的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:培养细胞至70~80%融合度时,将含有表达载体px459-stat1的混合液转染进细胞中并培养。
8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,所述培养的温度为35~39℃,培养的时间为12~16h。
9.一种stat1基因缺失细胞株系,其特征在于,所述细胞株系由权利要求7~8任一项构建方法获得。
10.一种用于stat1基因敲除试剂盒,其特征在于,包括如下(1)~(4)中的任意一种: