一种乙醛脱氢酶突变体及其在热加工食品中的应用

本发明涉及酶工程和食品工业，特别是涉及一种乙醛脱氢酶突变体及其在热加工食品中的应用。

背景技术：

1、随着国民经济实力和生活水平的不断提升，人们对生活品质和健康的需求日益增加，食品营养和安全问题受到广泛的关注。食品原材料在热加工过程中增加食品风味和香气的同时，也会产生一些有毒有害的物质，如苯丙芘、丙烯酰胺、多环芳烃、羟甲基糠醛、晚期糖基化终产物和晚期脂质过氧化终产物等。丙烯酰胺是2a级致癌物，主要在加热过程中产生，由于其潜在的神经、遗传毒性和致癌性而受到越来越多的关注，许多疾病并发症的发展(如肝癌、结肠肿瘤、糖尿病、衰老和阿兹海默症等疾病并发症)都与丙烯酰胺及其代谢产物在人体内的形成和积累密切相关。因此，减少热加工食品中丙烯酰胺的含量是亟需解决的食品安全性问题。

2、丙烯酰胺可以由前体物质游离天冬酰胺和还原糖生成；l-天冬酰胺酶能够催化l-天冬酰胺脱氨生成l-天冬氨酸和氨，可以利用该酶来降解油炸、烘焙等高温处理食品中致癌物质丙烯酰胺的前体物质l-天冬酰胺的含量，从源头上降低丙烯酰胺的含量，目前已被应用于食品行业中。此外，丙烯酰胺还可以通过食品中的醛类物质由一系列复杂的化学反应形成；而醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,aldh)超家族是一类依赖nad(p)+的多功能蛋白，可通过氧化反应催化内源性和外源性醛，使之不可逆地转变为相应的酸，从源头上保护机体免受醛类物质及其代谢产物的毒害，在食品安全和大健康领域中有巨大的应用前景。目前尚无类似的研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种乙醛脱氢酶突变体及其在热加工食品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该乙醛脱氢酶突变体的酶活力和热稳定性相比野生型乙醛脱氢酶都提高，该乙醛脱氢酶突变体应用于热加工食品中可以显著降低丙烯酰胺的含量，拓宽了乙醛脱氢酶的应用范围，也有助于提高热加工食品的安全性。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种乙醛脱氢酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：1、seq id no：3和seq id no：5所示序列中的任一项。

4、seq id no：1如下所示：

5、mlrtatrttfksaqpsfmaaaaalryyshyplsksitlpngkvyeqptglfingefvasqqhktfevinpsnedeichvyeartedvdaavdaaynafhsewskmdpsirgehlmklaelmeknkdtlaaiesmdngkalfmaeidvklvinylkycagwadklfgkvvdtgsnyfnyikrepigvcgqiipwnfpllmwswkvgpalaagntivlktaestplsalyaaklakeagipdgvinivsgfgkitgeaisthpkikklaftgstatgkhimkaaaesnlkkvtlelggkspnivfndadikkavnnlilgiffnsgevccagsrvfiqegvydqvleefkiaaealkvgnpfeegvfqgaqtsqqqltkilgyvesgkdegatlvtggerlgdkgyfvkptifadvkpnmkiyseeifgplavvtkfktadeaiamandseyglaagihttsldtatyvannleagtvwintyndfhhnmpfggfkqsgigremgeaafenytqwktvriaindgpq.

6、seq id no：3如下所示：

7、mlrtatrttfksaqpsfmaaaaalryyshyplsksitlpngkvyeqptglfingefvasqqhktfevinpsnedeichvyeartedvdaavdaaynafhsewskmdpsirgehlmklaelmeknkdtlaaiesmdngkalfmaeidvklvinylkycagwadklfgkvvdtgsnyfnyikrepigvcgqiipwnfpllmwswkvgpalaagntivlktaestplsalyaaklakeagipdgvinivsgfgkitgeaisthpkikklaftgstatgkhimkaaaesnlkkvtlelggkspnivfndadikkavnnlilgiffnsgevccagsrvfiqegvydqvleefkiaaealkvgnpfeegvfqgaqtsqqqltkilgyvesgkdegatlvtggerlgdkgyfvkptifadvkpnmkiyseeifgpiavvtkfktadeaiamandseyglaagihttsldtatyvannleagtvwintyndfhhnmpfggfkqsgigremgeaafenytqwktvriaindgpq.

8、seq id no：5如下所示：

9、mlrtatrttfksaqpsfmaaaaalryyshyplsksitlpngkvyeqptglfingefvasqqhktfevinpsnedeichvyeartedvdaavdaaynafhsewskmdpsirgehlmklaelmeknkdtlaaiesmdngkalfmaeidvklvinylkycagwadklfgkvvdtgsnyfnyikrepigvcgqiipwnfpllmwswkvgpalaagntivlktaestplsalyaaklakeagipdgvinivsgfgkitgeaisthpkikklaftgstatgkhimkaaaesnlkkvtlelggkspnivfndadikkavnnlilgiffnsgevccagsrvfiqegvydqvleefkiaaealkvgnpfeegvfqgaqtsqqqltkilgyvesgkdegatlvtggerlgdkgyfvkptifadvkpnmkiyseeifgpvavvtkfktadeaiamandseyglaagihttsldtatyvannleagtvwintyndfhhnmpfggfkqsgigremgeaafenytqwktvriaindgpq.

10、本发明还提供编码所述的乙醛脱氢酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no：2、seq id no：4和seq id no：6所示序列中的任一项。

11、seq id no：2如下所示：

12、atgctgagaactgccacacgtacgacatttaaaagcgctcaaccatcctttatggccgctgcagctgcactgcgttattattctcattatcctttgagcaaaagcattactctaccgaatggaaaagtttatgagcagccgacgggcttatttatcaacggtgaatttgttgctagccagcagcataaaacattcgaagttattaatccgagtaatgaagacgagatctgtcacgtctacgaagcgcgtaccgaggatgttgatgcggcagttgatgctgcctacaatgcttttcattcagaatggtctaaaatggatccgtccatccgaggagagcatttaatgaagctggcagagctgatggaaaaaaataaagatacgctggcagcgattgaatcaatggacaatggcaaggcactgtttatggcagaaattgatgtgaaactcgttatcaattatttgaaatattgcgcgggctgggcggataagctgtttggaaaagtcgtcgacactggcagcaattactttaactacatcaaacgggagccgattggtgtgtgtggacagatcattccatggaatttcccgctgctgatgtggagctggaaggttggcccagccctcgcggcaggaaatacaatcgtactgaagaccgcagaaagtaccccgctgagcgcactttatgcggcaaaactggcaaaagaagcaggaattcctgatggtgttattaatattgtcagcggcttcggcaaaatcaccggtgaggcaatcagcactcatcctaagatcaaaaagctggcgtttactgggtccaccgccacaggtaaacatatcatgaaggcagcggccgaatccaacctgaaaaaagtgaccctagaactgggtggcaaatcaccgaatattgttttcaatgatgccgacattaaaaaagctgtcaataatcttattctgggcatatttttcaacagcggtgaggtttgctgtgcgggttcacgcgtgtttatccaggaaggcgtgtatgaccaggtactggaagaattcaaaatagcggctgaagctctgaaagtcggtaacccatttgaggaaggagtatttcaaggggcccaaacaagtcaacagcagctgacgaaaattctcggttatgtagaaagcgggaaggatgaaggtgctactcttgtaactgggggtgaacgtctaggtgataaaggctattttgtcaaaccaaccatattcgccgatgtcaagccgaacatgaaaatctattctgaagagatcctcggaccgtttgccgttgttacgaaatttaagacagctgatgaagccattgcgatggccaatgactccgaatacggcctggcagcaggtattcatacaaccagcctcgatacagccacctatgttgcaaataatttagaagcgggaaccgtgtggatcaatacgtataacgactttcaccataatatgccgtttggcggttttaagcagtctggaataggtcgggaaatgggagaagcggcatttgaaaactatacacaatggaaaaccgtacgtatcgcaattaacgatggtccgcaataa.

13、seq id no：4如下所示：

14、atgctgagaactgccacacgtacgacatttaaaagcgctcaaccatcctttatggccgctgcagctgcactgcgttattattctcattatcctttgagcaaaagcattactctaccgaatggaaaagtttatgagcagccgacgggcttatttatcaacggtgaatttgttgctagccagcagcataaaacattcgaagttattaatccgagtaatgaagacgagatctgtcacgtctacgaagcgcgtaccgaggatgttgatgcggcagttgatgctgcctacaatgcttttcattcagaatggtctaaaatggatccgtccatccgaggagagcatttaatgaagctggcagagctgatggaaaaaaataaagatacgctggcagcgattgaatcaatggacaatggcaaggcactgtttatggcagaaattgatgtgaaactcgttatcaattatttgaaatattgcgcgggctgggcggataagctgtttggaaaagtcgtcgacactggcagcaattactttaactacatcaaacgggagccgattggtgtgtgtggacagatcattccatggaatttcccgctgctgatgtggagctggaaggttggcccagccctcgcggcaggaaatacaatcgtactgaagaccgcagaaagtaccccgctgagcgcactttatgcggcaaaactggcaaaagaagcaggaattcctgatggtgttattaatattgtcagcggcttcggcaaaatcaccggtgaggcaatcagcactcatcctaagatcaaaaagctggcgtttactgggtccaccgccacaggtaaacatatcatgaaggcagcggccgaatccaacctgaaaaaagtgaccctagaactgggtggcaaatcaccgaatattgttttcaatgatgccgacattaaaaaagctgtcaataatcttattctgggcatatttttcaacagcggtgaggtttgctgtgcgggttcacgcgtgtttatccaggaaggcgtgtatgaccaggtactggaagaattcaaaatagcggctgaagctctgaaagtcggtaacccatttgaggaaggagtatttcaaggggcccaaacaagtcaacagcagctgacgaaaattctcggttatgtagaaagcgggaaggatgaaggtgctactcttgtaactgggggtgaacgtctaggtgataaaggctattttgtcaaaccaaccatattcgccgatgtcaagccgaacatgaaaatctattctgaagagatcataggaccgtttgccgttgttacgaaatttaagacagctgatgaagccattgcgatggccaatgactccgaatacggcctggcagcaggtattcatacaaccagcctcgatacagccacctatgttgcaaataatttagaagcgggaaccgtgtggatcaatacgtataacgactttcaccataatatgccgtttggcggttttaagcagtctggaataggtcgggaaatgggagaagcggcatttgaaaactatacacaatggaaaaccgtacgtatcgcaattaacgatggtccgcaataa.

15、seq id no：6如下所示：

16、atgctgagaactgccacacgtacgacatttaaaagcgctcaaccatcctttatggccgctgcagctgcactgcgttattattctcattatcctttgagcaaaagcattactctaccgaatggaaaagtttatgagcagccgacgggcttatttatcaacggtgaatttgttgctagccagcagcataaaacattcgaagttattaatccgagtaatgaagacgagatctgtcacgtctacgaagcgcgtaccgaggatgttgatgcggcagttgatgctgcctacaatgcttttcattcagaatggtctaaaatggatccgtccatccgaggagagcatttaatgaagctggcagagctgatggaaaaaaataaagatacgctggcagcgattgaatcaatggacaatggcaaggcactgtttatggcagaaattgatgtgaaactcgttatcaattatttgaaatattgcgcgggctgggcggataagctgtttggaaaagtcgtcgacactggcagcaattactttaactacatcaaacgggagccgattggtgtgtgtggacagatcattccatggaatttcccgctgctgatgtggagctggaaggttggcccagccctcgcggcaggaaatacaatcgtactgaagaccgcagaaagtaccccgctgagcgcactttatgcggcaaaactggcaaaagaagcaggaattcctgatggtgttattaatattgtcagcggcttcggcaaaatcaccggtgaggcaatcagcactcatcctaagatcaaaaagctggcgtttactgggtccaccgccacaggtaaacatatcatgaaggcagcggccgaatccaacctgaaaaaagtgaccctagaactgggtggcaaatcaccgaatattgttttcaatgatgccgacattaaaaaagctgtcaataatcttattctgggcatatttttcaacagcggtgaggtttgctgtgcgggttcacgcgtgtttatccaggaaggcgtgtatgaccaggtactggaagaattcaaaatagcggctgaagctctgaaagtcggtaacccatttgaggaaggagtatttcaaggggcccaaacaagtcaacagcagctgacgaaaattctcggttatgtagaaagcgggaaggatgaaggtgctactcttgtaactgggggtgaacgtctaggtgataaaggctattttgtcaaaccaaccatattcgccgatgtcaagccgaacatgaaaatctattctgaagagatcgtcggaccgtttgccgttgttacgaaatttaagacagctgatgaagccattgcgatggccaatgactccgaatacggcctggcagcaggtattcatacaaccagcctcgatacagccacctatgttgcaaataatttagaagcgggaaccgtgtggatcaatacgtataacgactttcaccataatatgccgtttggcggttttaagcagtctggaataggtcgggaaatgggagaagcggcatttgaaaactatacacaatggaaaaccgtacgtatcgcaattaacgatggtccgcaataa.

17、本发明还提供包含所述的基因的重组表达载体。更优选的是，所述重组表达载体为pet-28a，pet-29a，pet-30a，pet-32a，pcold i，pcold ii等大肠杆菌常用表达载体中的任意一种。

18、本发明还提供包含所述的重组载体的宿主菌。所述宿主菌为bl21(de3)、c41(de3)、c43(de3)、bl21(de3)plyse、origami系列、ad494(de3)、bl21 trxb(de3)、shufflet7等大肠杆菌常用表达宿主中的任意一种。

19、本发明还提供所述的乙醛脱氢酶突变体或所述的基因或所述的重组表达载体或所述的宿主菌在如下(1)或(2)中的应用：

20、(1)在制备丙烯酰胺降低的热加工食品中的应用；

21、(2)在降低丙烯酰胺中的应用。

22、本发明还提供一种所述的乙醛脱氢酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

23、将所述乙醛脱氢酶突变体的编码基因与表达载体重组，构建重组表达载体；

24、将所述重组表达载体转入宿主菌，构建重组工程菌；

25、对所述重组工程菌进行发酵培养，再经纯化，得到乙醛脱氢酶突变体。

26、优选的是，所述重组工程菌进行发酵培养的方法包括以下步骤：将所述重组工程菌的种子液接种至发酵培养基，置于37℃、200rpm条件下震荡培养2～3h，待培养液的od600值达到0.8时，添加iptg并于16℃条件下诱导表达16h；

27、其中，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、葡萄糖10g/l、氯化钠10g/l；所述发酵培养基的溶剂为去离子水。

28、优选的是，所述纯化为采用镍柱亲和层析法进行纯化。

29、本发明还提供一种降低热加工食品中丙烯酰胺的方法，用所述的乙醛脱氢酶突变体酶液浸泡待热加工的食品，之后再进行热加工处理，以减少所述待热加工的食品中丙烯酰胺的含量。

30、优选的是，所述热加工处理包括油炸和烘焙。

31、本发明公开了以下技术效果：

32、本发明公开了一种乙醛脱氢酶突变体，通过实验发现，该乙醛脱氢酶突变体的热稳定性和活力均较野生型有所提高。利用乙醛脱氢酶突变体应用热加工食品中的前处理中，将食品置于缓冲液中，并加入乙醛脱氢酶突变体降低丙烯酰胺的前体物质，进而有效降低高温处理食品中的丙烯酰胺含量，拓宽了生物酶制剂在热加工食品有害物质消减中的应用。