B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用

本发明涉及一种病毒反向遗传操作系统及其应用，特别涉及一种b亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用。本发明属于生物。

背景技术：

1、禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, ampv)是一种高度传染性的病原体，可引起火鸡急性呼吸道疾病，也与鸡的"肿头综合征"有关。ampv单一感染时死亡率较低，但易与新城疫病毒，传染性支气管炎病毒或大肠杆菌等病原体发生混合感染，从而导致更严重的呼吸道症状和较高死亡率。ampv于1978年在南非被首次分离报道，之后在全球主要的家禽饲养区广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。

2、ampv属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒属家族的成员。其基因组为不分节段的单股负链rna，基因排列顺序为3'-leader-n-p-m-f-m2-sh-g-l-trailer-5'。基于g蛋白的抗原性差异，国际病毒分类委员会（ictv）将ampv分为a、b、c和d四个亚型。a亚型和b亚型ampv在世界大多数国家均广泛流行，目前，b亚型ampv已成为我国主要的优势流行毒株。

3、反向遗传操作系统是研究病毒致病机制与新型载体疫苗的理想工具，但目前针对b亚型ampv的反向遗传操作系统尚不成熟。因此，本发明以本实验室获得的b亚型弱毒疫苗株ln16-a为研究对象，利用同源重组技术成功构建了病毒的全长cdna感染性克隆，并进一步评价了其作为载体疫苗的潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒；

2、本发明的目的之二在于提供一种含有上述质粒的b亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其在研究病毒致病机制与新型疫苗中的应用；

3、本发明的目的之三在于提供一种利用上述反向遗传操作系统获得的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株及其在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒超强毒以及b亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。

4、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

5、本发明的一种b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒，所述的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒是以ampv ln16-a株（记载在公开号为cn115287270a，发明名称为b亚型禽偏肺病毒传代致弱株及其应用的专利申请中）全长基因组为骨架，通过反转录和rt-pcr获得五个cdna片段（a-e），每个片段之间含有15-20 bp的同源臂，五个片段的总长度覆盖了ln16-a株的完整序列。为与亲本病毒进行区分，在a片段（基因组第202核苷酸位点）引入一个可以与亲本病毒区分的遗传分子标记。将5个cdna片段克隆至pmd18-t载体中，测序正确后置于-20℃保存备用。人工合成包括t7启动子、hdvrz核酶序列和t7终止子的序列，并在t7启动子和hdvrz核酶序列之间保留 ecor v酶切位点，将该片段与pok12进行同源重组，得到修饰后的pok12载体，命名为gpok12。使用 ecor v将gpok12线性化后，利用同源重组技术将a-e五个片段重组到gpok12载体中，获得ampv ln16a株的全长cdna感染性克隆质粒，命名为pok-ln16a，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、进一步的，本发明还提出了所述的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒在以下方面的应用：

7、（1）通过病毒拯救获得重组b亚型禽偏肺病毒中的应用；

8、（2）作为病毒载体的应用。

9、再进一步的，本发明还提出了一种b亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，所述的反向遗传操作系统包括所述的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒以及辅助质粒，所述的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒的核苷酸序列如seq id no.1所示。

10、其中，优选的，所述的辅助质粒包括pcaggs-n、pcaggs-p、pcaggs-m21以及pcaggs-l。

11、其中，优选的，所述的辅助质粒pcaggs-n，pcaggs-p，pcaggs-m21，pcaggs-l通过以下方法制备得到：

12、以提取得到的ampv ln16-a株病毒的rna进行反转录，以获得的cdna为模板，使用引物对ln16-a株的n、p、m2-1及l基因的orf进行pcr扩增，将扩增得到的pcr片段与pcaggs载体采用ecor i和xho i双酶切后进行连接，挑取单克隆菌落并进行测序验证，将测序正确的四个辅助质粒分别命名为pcaggs-n、pcaggs-p、pcaggs-m21、pcaggs-l，引物序列如下：

13、

14、再进一步的，本发明还提出了所述的b亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统在研究b亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以b亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗中的应用。

15、其中，优选的，所述的疫苗为表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒（very virulentibdv, vvibdv）vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗。

16、更进一步的，本发明还提出了一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，所述的疫苗株是通过将包含vvibdv vp2基因的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒进行病毒拯救后获得的；所述的包含vvibdv vp2基因的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒是将vvibdv-hlj0504株vp2基因的转录表达盒插入所述的b亚型禽偏肺病毒全长cdna感染性克隆质粒的g和l基因之间得到的。

17、其中，优选的，所述的vvibdv-hlj0504株vp2基因的转录表达盒的核苷酸序列如seq id no.2所示，插入位点位于seq id no.1所示序列的9015-9016 bp之间。

18、更进一步的，本发明还提出了所述的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒以及b亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。

19、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

20、首先，本发明建立了b亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，本发明以ampv ln16-a株全长基因组为骨架，通过反转录和rt-pcr获得五个cdna片段（a-e），同时为与亲本病毒进行区分，在a片段（基因组第202核苷酸位点）引入一个可以与亲本病毒区分的遗传分子标记。将5个cdna片段克隆重组到修饰后的pok12载体中，获得ampv ln16a株的全长cdna感染性克隆质粒，命名为pok-ln16a，其核苷酸序列如seq id no.1所示。实验证明，遗传分子标记a→g的引入并不影响病毒的生长和复制，拯救病毒与亲本病毒在vero细胞上具有相似的生长特性。

21、其次，本发明通过筛选适合外源基因表达的最佳插入位点，最终发现在ampvln16a株的全长cdna感染性克隆质粒g和l基因之间的位点可以作为外源蛋白表达的插入位点，在该位点表达外源蛋白不影响病毒的复制，且外源蛋白表达水平最高。因此，该系统在研究b亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以b亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗方面具有广阔的应用前景。

22、再次，为进一步评价ampv ln16a株的全长cdna感染性克隆质粒作为载体疫苗的潜力，本发明将vvibdv-hlj0504株的vp2蛋白插入基因组g和l基因之间，获得了一株可稳定表达vvibdv vp2的b亚型禽偏肺病毒重组弱毒候选疫苗株，命名为rln16a-vvvp2株，进一步对rln16a-vvvp2株免疫保护效果进行评价，结果发现rln16a-vvvp2株可对vvibdv和ampv两种病毒提供100%的免疫保护。本发明的提出为这两种病毒病的防控提供了新的技术手段，对家禽业健康发展具有重要意义。