表达IBDVVP2蛋白的B亚型禽偏肺病毒疫苗株

本发明涉及一种表达传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的b亚型禽偏肺病毒疫苗株及其制备方法和应用，特别涉及一种表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株及其制备方法和应用。本发明属于生物。

背景技术：

1、禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, ampv)是一种具有高度传染性的病原体，主要通过直接接触或者间接接触的水平方式传播。ampv的自然宿主是鸡和火鸡，主要引起火鸡鼻气管炎和鸡的肿头综合征。ampv单一感染致死率不高，但易与大肠杆菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体发生混合感染，从而导致死亡率增加。20世纪70年代末，ampv首次在南非被分离报道，之后在英国、法国、西班牙及德国等多个欧洲国家广泛流行。目前，除大洋洲以外的世界各地均有该病的报道，给养禽业带来巨大的经济损失。

2、ampv属于副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属。ampv基因组全长约为13.1~14.2kb，为不分节段的单股、负链rna，基因排列顺序为3’-n-p-m-f-m2-sh-g-l-5’。与其它基因相比，g基因核苷酸和氨基酸序列变异程度最大，因此，该基因常被用于分子流行病学调查及病毒亚型的鉴定。基于g基因序列的不同，ampv可分为a、b、c和d四种亚型。研究表明，a、b亚型毒株分布范围更广，存在于除北美和澳大利亚之外的大多数国家，对家禽业威胁也最为严重。此外，基于国内的流行病学调查显示，b亚型ampv已成为中国优势亚型流行毒株。

3、传染性法氏囊病（infectious bursal disease，ibd）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，ibdv）引起的一种高度接触性、急性及免疫抑制性的传染病。ibdv主要感染3-6周龄雏鸡，感染鸡群主要表现为法氏囊及肾脏的严重损伤，对其它病原体的易感性增加。ibdv为双rna病毒科禽双rna病毒属家族的成员，无囊膜，由核酸和衣壳构成。其中，衣壳蛋白主要由vp2组成，vp2表面存在多种抗原表位，可诱导宿主产生中和抗体，是ibdv的主要保护性抗原。

4、ibdv有两种血清型，其中只有血清i型对鸡有致病性，血清i型毒株可分为经典毒株(classic ibdv, cibdv)、变异株(variant ibdv, varibdv)、超强毒株(very virulentibdv, vvibdv)和弱毒株(attenuated ibdv, aibdv)。1957年，cibdv在美国被首次分离报道，之后在全世界范围内的流行态势进一步扩大。1987年，jackwood等首次发现了varibdv，据报道varibdv可以突破cibdv的免疫保护。vvibdv于20世纪80年代末传入中国，与cibdv和varibdv相比，vvibdv致病能力更强，致死率通常可达60%以上。近年来，由于疫苗的合理使用与饲养管理，vvibdv在我国的流行已逐步得到控制。自2017年以来，一种与早期varibdv基因不同的新型varibdv（novel variant ibdv, nvaribdv)在中国的免疫鸡场中广泛流行。nvaribdv虽然不能导致鸡死亡，但会直接损害鸡的法氏囊、脾脏、肾脏等免疫器官，导致严重的免疫抑制，进而影响鸡的增重和生产性能。由于抗原性的差异，现有针对cibdv和vvibdv的商品化疫苗对nvaribdv不能提供完全保护，因此亟需研究针对nvaribdv的高效疫苗。

5、本发明利用反向遗传操作技术，获得了一株可以稳定表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株，本发明的提出为b亚型ampv和nvaribdv两种病毒病的防控提供了一定技术支持与理论指导，对家禽业健康发展具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒；

2、本发明的目的之二在于提供由所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒通过病毒拯救后获得的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株及其应用。

3、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

4、首先，本发明的一种表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的b亚型重组禽偏肺病毒株全长cdna 感染性克隆质粒，所述的质粒是将nvaribdv-shg19株vp2蛋白的基因转录盒插入重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒的g和l基因之间的非编码区得到的，其中，所述的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、其中，优选的，nvaribdv-shg19株vp2蛋白的基因转录盒的核苷酸序列如seq idno.2所示，插入位点位于所述的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒的9015-9016 bp之间。

6、进一步的，本发明还提出了所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒在病毒拯救中的应用，是将所述的质粒通过病毒拯救的方式获得表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒。

7、再进一步的，本发明还提出了一种表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株，所述的疫苗株是由所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒通过病毒拯救后获得的。

8、其中，优选的，所述的病毒拯救包括以下步骤：

9、将所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒pok-ln16a-nvarvp2与辅助质粒pcaggs-n，pcaggs-p，pcaggs-m21，pcaggs-l共转染到bsr-t7/5细胞中，转染5天后收集上清感染vero细胞，同时设置正常bsr-t7/5细胞上清感染组，作为空白对照组。将病毒通过vero细胞连续传代，选取3、5、10、15代进行基因组提取和反转录，以获得的cdna为模板，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，获得传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白稳定表达的重组b亚型禽偏肺病毒，所述的辅助质粒pcaggs-n，pcaggs-p，pcaggs-m21，pcaggs-l为分别表达b亚型禽偏肺病毒株ln16-a株n、p、m2-1及l基因的pcaggs载体。

10、其中，优选的，将所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒株全长cdna感染性克隆质粒pok-ln16a-nvarvp2与辅助质粒pcaggs-n，pcaggs-p，pcaggs-m21，pcaggs-l按照4：1：1：1：1的比例共转染到bsr-t7/5细胞中。

11、其中，优选的，所述的辅助质粒pcaggs-n，pcaggs-p，pcaggs-m21，pcaggs-l通过以下方法制备得到：以提取得到的ampv ln16-a株病毒的rna进行反转录，以获得的cdna为模板，使用引物对ln16-a株的n、p、m2-1及l基因的orf进行pcr扩增，将扩增得到的pcr片段与pcaggs载体采用ecor i和xho i双酶切后进行连接，挑取单克隆菌落并进行测序验证，将测序正确的四个辅助质粒分别命名为pcaggs-n、pcaggs-p、pcaggs-m21、pcaggs-l，引物序列如下：

12、

13、更进一步的，本发明还提出了所述的表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株在制备预防传染性法氏囊病病毒新型变异株和b亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。

14、其中，优选的，所述的传染性法氏囊病病毒为传染性法氏囊病病毒新型变异株(novel variant ibdv, nvaribdv)。

15、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

16、本发明利用反向遗传操作技术，以本实验室获得的b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株ln16-a为骨架，将nvaribdv-shg19株的vp2基因插入b亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株ln16-a基因组g和l基因之间，获得了一株可以稳定表达传染性法氏囊病病毒新型变异株vp2蛋白的重组b亚型禽偏肺病毒疫苗株，命名为rln16a-nvarvp2株。复制动力学测定结果表明，vp2的插入不会影响病毒的复制能力。将rln16a-nvarvp2株免疫2周龄spf鸡并进行了免疫保护评价，发现rln16a-nvarvp2株可同时诱导免疫鸡只产生针对b亚型ampv和nvaribdv的中和抗体，可对b亚型ampv和nvaribdv两种病毒提供100%免疫保护，并且有效的预防b亚型ampv和nvaribdv对靶器官鼻甲骨和法氏囊的病理损伤。因此，本发明为b亚型ampv和nvaribdv两种病毒病的防控提供了新的技术手段，对家禽业健康发展具有重要意义。