一种海参美人鱼发光杆菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测试剂盒

本发明属于水产养殖病原微生物诊断领域，具体涉及一种海参美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)的taqman探针荧光定量pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、海参参腐皮综合征，俗称化皮病，是当前养殖海参最主要疾病，死亡率可达90％以上，在保苗期和养成期均可发病。目前，关于海参腐皮综合征的流行病学研究较少，对其具体发病原因仍不清楚。已报到的致病病原主要包括细菌性病原，如弧菌属，希瓦氏菌属、发光杆菌属、葡萄球菌属、假交替单胞杆菌以及一些病毒性病原和寄生虫病原(后口虫和纤毛虫)等。同时，也有学者认为水温、饲料和盐度等非生物因子与海参腐皮综合征的发生相关。不管是何种因素引起的，其症状基本相同。首先，海参触手过度张开，接着口部肿大，分泌黏液增多，触手失去伸展活力，然后口部出现溃烂，开始是小的白斑，然后扩大到整个口部，溃烂处产生大量黏液，口与肛门处有白色絮状物粘连，直至全身溃烂直至死亡。

2、美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)是一种革兰氏阴性菌，直杆状，以1～3根鞭毛运动，有的不运动。其大小在0.8～1.3μm×1.8～2.4μm，兼性厌氧，化能异养菌，具有呼吸和发酵代谢类型。据报道，美人鱼发光杆菌能够感染许多水产经济动物如鱼和虾等。最新研究表明，美人鱼发光杆菌能够引起仿刺参腐皮综合征，流行病学调查结果显示，该病原对各个生长阶段的海参均有致病性，已成为影响南方海参养殖业主要的病原之一，给海参养殖业造成巨大的经济损失。但是到目前为止，针对该病没有有效的防控策略，其中最主要的原因在于很难实现早期的病原诊断。目前，对美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)的检测主要采用常规的细菌培养分离与鉴定、形态学观察、生理生化水平检测等方法。但这些方法有的耗时长，操作繁琐，且准确度和灵敏度较低。因此，亟需开发出兼具快速、准确、高特异性和灵敏度的检测方法，实现对美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)进行早期的诊断、监控和预警，为该病原防控提供支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种海参美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)的taqman探针荧光定量pcr检测试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种海参美人鱼发光杆菌的taqman探针荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒中包含用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针；所述用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针序列如下所示：

4、photobacterium damselae detection-f：5'-cgaagatgaagacgaaga-3'，

5、photobacterium damselae detection-r：5'-ctgcttgaagatctcaga-3'，photobacterium damselae detection-probe：5'-fam-cagcgacgacagcgatgaca-bhq1-3'。

6、进一步的，上述试剂盒中还包含premix ex-taq(probe qpcr)、美人鱼发光杆菌阳性对照样品和美人鱼发光杆菌阴性对照样品。

7、进一步的，上述试剂盒的taqman探针荧光定量pcr扩增反应体系包括：0.4μl10mm的photobacterium damselae detection-f，0.4μl 10mm的photobacterium damselaedetection-r，0.4μl 10mm的photobacterium damselae detection-probe，10μl premixex-taq(probe qpcr)，7.8μl双蒸水，dna模板1μl。

8、进一步的，上述试剂盒的taqman探针荧光定量pcr扩增反应条件包括：94℃预变性3min；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行40个循环。

9、进一步的，上述试剂盒中美人鱼发光杆菌阳性对照样品为重组质粒peasy-blunt-rpod，所述美人鱼发光杆菌阴性对照样品为灭菌超纯水；所述重组质粒peasy-blunt-rpod是将美人鱼发光杆菌的rpod基因目的片段插入peasy-blunt-zero载体中获得，所述美人鱼发光杆菌的rpod基因目的片段如seq id no.1所示。

10、进一步的，上述试剂盒的结果判定依据为：如果在美人鱼发光杆菌阴性对照样品无ct值且无扩增曲线、美人鱼发光杆菌阳性对照样品ct值<35且有“s”型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值≤35且有“s”型扩增曲线时，则待测样品感染美人鱼发光杆菌；如果在美人鱼发光杆菌阴性对照样品无ct值且无扩增曲线、美人鱼发光杆菌阳性对照样品ct值<35且有“s”型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值＞35或无扩增曲线时，则待测样品未感染美人鱼发光杆菌。

11、本发明的显著优点在于：

12、本发明利用美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)的rpod基因保守序列设计一对引物，优化pcr反应条件和反应体系，建立起检测美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)的taqman荧光定量pcr检测方法，在此基础上装配出简便、快速、灵敏、特异的一种美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)检测试剂盒，该试剂盒可用于对养殖海参以及养殖水体中的细菌的准确、定量地跟踪监测，从而及时对美人鱼发光杆菌(photobacterium damselae)引发的海参腐皮综合征进行有效的防控与治疗，具有很高的实用价值。

技术特征：

1.一种海参美人鱼发光杆菌的taqman探针荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针；所述用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针序列如下所示：

2.根据权利要求1所述的试剂盒：其特征在于：所述试剂盒中还包含premix ex-taq（probe qpcr）、美人鱼发光杆菌阳性对照样品和美人鱼发光杆菌阴性对照样品。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的taqman探针荧光定量pcr扩增反应体系包括：0.4μl 10mm的photobacterium damselae detection-f，0.4μl 10mm的photobacterium damselae detection-r，0.4μl 10mm的photobacterium damselae detection-probe，10μl premix ex-taq（probe qpcr），7.8μl双蒸水，dna模板1μl。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的taqman探针荧光定量pcr扩增反应条件包括：94℃预变性3min；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行40个循环。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述美人鱼发光杆菌阳性对照样品为重组质粒peasy-blunt-rpod，所述美人鱼发光杆菌阴性对照样品为灭菌超纯水；所述重组质粒peasy-blunt-rpod是将美人鱼发光杆菌的rpod基因目的片段插入peasy-blunt-zero载体中获得，所述美人鱼发光杆菌的rpod基因目的片段如seq id no.1所示。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的结果判定依据为：如果在美人鱼发光杆菌阴性对照样品无ct值且无扩增曲线、美人鱼发光杆菌阳性对照样品ct值<35且有“s”型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值≤35且有“s”型扩增曲线时，则待测样品感染美人鱼发光杆菌；如果在美人鱼发光杆菌阴性对照样品无ct值且无扩增曲线、美人鱼发光杆菌阳性对照样品ct值<35且有“s”型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值＞35或无扩增曲线时，则待测样品未感染美人鱼发光杆菌。

技术总结
本发明涉及一种海参美人鱼发光杆菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测试剂盒，属于水产养殖病原微生物诊断领域。所述试剂盒中包含用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针；所述用于检测美人鱼发光杆菌的引物和探针序列为：5'‑CGAAGATGAAGACGAAGA‑3'，5'‑CTGCTTGAAGATCTCAGA‑3'，5'‑FAM‑CAGCGACGACAGCGATGACA‑BHQ1‑3'。本发明根据美人鱼发光杆菌rpoD基因序列设计一对特异性引物和一条特异性荧光探针，利用TaqMan探针荧光定量PCR技术检测美人鱼发光杆菌，操作简单、检测准确度高、敏感性强。本发明为海参美人鱼发光杆菌诊断、流行监测以及防控提供了工具，具有很高的应用价值。

技术研发人员：陈新华,覃盼,吴彤,杨求华
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24