一种强化细菌种间电子传递的方法

本发明属于生物电化学，具体涉及一种强化细菌种间电子传递的的方法。

背景技术：

1、种间电子传递(iet)是微生物相互作用的一种关键机制，它使微生物能够交换电子，并且促进微生物群落内部的合作与协同反应。iet支持的微生物相互作用在产甲烷微生物联合体、污染物降解、硝化反硝化联合体、厌氧共培养光合作用以及其他生物地球化学循环和工业应用中发挥着重要作用。

2、种间电子转移主要分为间接种间电子转移(miet)和直接种间电子转移(diet)。miet指微生物通过分泌的溶解性电子载体(比如氢气或甲酸、乙酸、核黄素等各种有机化合物)间接地传递电子。在miet过程中，一个微生物产生电子载体，另一个微生物则利用这些载体作为电子受体或供体。而diet指两种微生物通过物理接触或特殊的导电结构(如细胞外纳米线)直接进行电子交换，这种方式通常在某些特定微生物，如geobacter属细菌。尽管天然的iet在环境微生物学中显示出电子传递能力，但是在但实际应用中天然的iet存在效率低下和应用限制等问题。因此，需要提高iet的效率。

3、为了提高iet的效率，科研工作者尝试了各种各样的方法。如有研究者往iet模型中加入外源的可介导miet的介质例如腐殖质与核黄素，但是可溶性介质在体系中的溶解度与扩散系数往往受到温度、ph、浓度等环境因素的影响，且电子在传递过程中也不可避免的会有损耗，这导致iet的效率降低。还有研究者通过基因工程高度表达电子受体菌与供体菌表面的导电菌毛与细胞色素来加强其iet。但是，一方面该方法需要等到菌自然团聚才能见效，需要较长的启动期，由于多数可参与iet的菌种并不是成熟的生物底盘菌，因此该方法不具有普适性；另一方面，基因工程操作难度较高，进一步地限制了该方法的普及使用。此外，还可以通过往iet体系中添加导电介质，包括导电碳材料(生物炭、碳布、颗粒活性炭)和纳米磁铁矿颗粒(如磁铁矿)等来强化iet。但是，一方面，引入导电材料也需要一段时间(45天)才能形成微生物团聚体启动iet，耗时较长；另一方面，导电材料的生物兼容性并不是很高，过量引入往往会对iet体系中微生物的生长以及代谢活动产生毒性，而在长期应用中导电材料也可能会因环境因素(如ph变化、温度波动)而降解或失去效能。并且，某些导电材料的生产和使用，尤其是在废弃和处理阶段可能对环境产生负面影响。因此，需要开发一种简便快速、稳定性强、绿色且高普适性的强化细菌种间电子传递的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的强化细菌种间电子传递的方法操作复杂、启动期较长、容易受外部环境影响、污染环境以及普适性低的问题，本发明提供了一种强化细菌种间电子传递的方法；本发明先在电子供体菌与电子受体菌表面分别修饰对应的叠氮(azido)或炔基(alkyne)基团，依靠点击化学(click chemistry)反应来使得炔烃与叠氮化物反应成环形(1,2,3-三唑)，通过共价键拉近电子供体菌与电子受体菌的距离来强化细菌种间电子传递；本发明所述方法简便快速、稳定性强、绿色且高普适性，在强化细菌种间电子传递中具有很好的应用。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明所述强化细菌种间电子传递的方法，包括以下步骤：

4、(1)在电子供体菌的细胞表面修饰叠氮基团或炔基基团，得到修饰后的电子供体菌；

5、在电子受体菌的细胞表面修饰与修饰后的电子供体菌对应的炔基基团或叠氮基团，得到修饰后的电子受体菌；

6、(2)分别将修饰后的电子供体菌、修饰后的电子受体菌离心、洗涤，然后采用pbs缓冲液重悬，分别得到修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液；

7、(3)将修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液混合，然后在恒温条件下进行huisgen叠氮化物-炔烃环加成反应，反应结束后即可强化细菌种间电子传递。

8、优选地，步骤(1)中，所述电子供体菌包括：奥奈达希瓦氏菌(shewanellaoneidensis mr-1)，硫还原地杆菌(geobacter sulfurreducens)，沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)中的任一种；

9、所述电子受体菌包：巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcina barkeri)，奥奈达希瓦氏菌(shewanella oneidensis mr-1)，沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)中的任一种。

10、优选地，步骤(1)中，表面修饰叠氮基团或炔基基团的方法包括：

11、使用带叠氮基团或炔基基团的糖类通过糖代谢工程在电子供体菌或电子受体菌表面聚糖，得到修饰后的电子供体菌悬浮液或修饰后的电子受体菌；或

12、使用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-叠氮基团或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-炔基基团与电子供体菌或电子受体菌表面的氨基(-nh2)酰胺化结合，得到修饰后的电子供体菌悬浮液或修饰后的电子受体菌。

13、优选地，所述带叠氮基团的糖类包括：叠氮半乳糖(胺)、叠氮葡萄糖(胺)、叠氮甘露糖(胺)中的任一种；

14、所述带炔基基团的糖类包括：炔基半乳糖(胺)、炔基葡萄糖(胺)、炔基甘露糖(胺)中的任一种；

15、所述炔基基团包括普通炔烃或应变的炔烃，优选为环状炔基，如环辛炔。

16、优选地，使用糖代谢工程在电子供体菌或电子受体菌表面聚糖的过程中，将过夜培养的电子供体菌或电子受体菌菌液与带叠氮基团或炔基基团的糖类混合，恒温振荡培养，得到所述修饰后的电子供体菌悬浮液或修饰后的电子受体菌悬浮液；

17、所述电子供体菌或电子受体菌菌液od600为1-2；

18、所述带叠氮基团或炔基基团的糖类终浓度为100～200μm；

19、所述恒温振荡为在30℃下振荡12～48h。

20、优选地，使用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-叠氮基团或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-炔基基团与电子供体菌或电子受体菌表面的氨基(-nh2)酰胺化结合的步骤为：

21、将过夜培养的电子供体菌或电子受体菌菌液与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-叠氮基团或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-炔基基团混合，恒温振荡培养，得到所述修饰后的电子供体菌悬浮液或修饰后的电子受体菌悬浮液；

22、所述电子供体菌或电子受体菌菌液od600为1-2；

23、所述n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-叠氮基团或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯-炔基基团终浓度为100～200μm；

24、所述恒温振荡为在30℃下振荡1h。

25、优选地，步骤(2)中，所述pbs缓冲液的ph值为7.4，其中加入了体积浓度为1％的牛血清蛋白(bsa)。

26、优选地，步骤(3)中，所述huisgen叠氮化物-炔烃环加成反应包括：铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(cuaac)或应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应(spaac)。

27、优选地，所述铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应的步骤为：

28、将修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液混合，向其中加入cu(ⅰ)催化剂，在30℃下静置反应30min。

29、优选地，所述铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应过程中，

30、修饰后的电子供体菌悬浮液、修饰后的电子受体菌悬浮液和cu(ⅰ)催化剂的体积比为0.5ml：0.5ml：0.1ml；所述修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液的od600＝0.5。

31、优选地，所述应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应的步骤为：

32、将修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液混合，吹打菌液混合均匀后在30℃下静置反应30min。

33、优选地，所述应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应的步骤为：

34、修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液的体积比为1：1；所述修饰后的电子供体菌悬浮液和修饰后的电子受体菌悬浮液的od600＝0.5。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

36、本发明先在电子供体菌与电子受体菌表面分别修饰对应的叠氮(azido)或炔基(alkyne)基团，依靠点击化学(click chemistry)反应来使得炔烃与叠氮化物反应成环形(1,2,3-三唑)，通过共价键拉近电子供体菌与电子受体菌的距离来强化细菌种间电子传递。

37、本发明所述方法克服了传统强化细菌种间电子传递方法中存在的操作复杂、启动期较长、容易受外部环境影响、污染环境以及普适性低的问题，具有简便快速、稳定性强、绿色且高普适性等优势，在强化细菌种间电子传递中具有很好的应用。

38、并且通过验证发现，经过本发明所述方法处理的体系中的细菌形成了紧凑的微生物团聚体，其之间的距离被拉进。在进一步的验证中发现，经过本发明所述方法处理的体系中甲烷的产量达到1.564nmol，相较于单纯混菌提高了约5.5倍；体系中氢气的产量达到15.493μmol，相较于单纯混菌提高了约2.5倍。体系中氢气、甲烷的产量的增加符合理论上的假设，是细菌间的种间电子传递的间接证据。因此，本发明所述方法能够提高细菌间的种间电子传递。