检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用

本发明涉及核酸检测，尤其涉及检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、由松材线虫（ bursaphelenchus xylophilus）引起的松材线虫病（pine wiltdisease, pwd）是一种对东亚和西欧的松林而言最具毁灭性灾害的病害。这种松树上的“癌症”为林业生产和经济发展都带来了严重的影响，并且当发现松树表现出较为明显的感病症状再采取防治方法时，已经很难挽回病害所造成的损失。

2、松材线虫的种类鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以pcr为基础的分子检测方法。由于松材线虫和拟松材线虫二者在形态学上的特征非常相似，仅能通过雌成虫形态上的差别进行区分，因此通过单一的形态学特征很难准确鉴定，并且该方法耗时、费力，需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然pcr检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但是需要昂贵的仪器设备，检测过程复杂，时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。

3、重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase aided amplification, raa）是一种新型体外恒温核酸扩增技术，该技术依赖于一对30-35bp长度的引物和三种酶（重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶），在37~42℃恒温条件下反应5~40min，即可快速完成核酸的大量扩增。raa扩增产物结合侧流层析试纸条（lateral flow dipstick assay, lfa）技术可以在40min内完成可视化检测。由于raa检测不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或者简单的恒温设备中都可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，已广泛应用于真菌、细菌、病毒等方面的快速检测。然而，目前尚无高灵敏度实现松材线虫的特异性检测的raa-lfa方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用。

2、具体地，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供检测松材线虫的特异性引物探针组，所述引物探针组包含核苷酸序列如seq id no.1-2所示的特异性引物对和核苷酸序列如seq id no.3所示的探针。

4、上述特异性引物对中，核苷酸序列如seq id no.1所示的引物为正向引物，核苷酸序列如seq id no.2所示的引物为反向引物。

5、上述特异性引物探针组为基于raa技术的引物探针组。

6、在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物探针组为基于raa-lfa技术的引物探针组。

7、本发明以松材线虫dna为模板，设计了多对raa引物进行扩增，经比较筛选后得到扩增效率最优的松材线虫raa检测引物（核苷酸序列如seq id no.1-2所示），该引物对具有较高的特异性和灵敏度。

8、优选地，核苷酸序列如seq id no.2所示的引物的5’端包含生物素（biotin）修饰。

9、优选地，所述探针为nfo探针，其5’端包含荧光基团修饰，3’端包含用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，探针的内部包含dspacer修饰。

10、nfo探针的结合位置位于正向引物和反向引物之间，在5’端标记荧光基团，中部标记有dspacer位点，在3’端标记扩增位阻基团。当dspacer位点两侧碱基与目标模板配对时，nfo酶被激活从而切割dspacer位点，扩增位阻基团从探针上被切除，最后形成的扩增产物5’端连接荧光基团，3’端连接生物素。

11、本发明中若无特殊说明，5’端是指5’末端，3’端是指3’末端。

12、对于荧光基团的选择，本发明没有特殊限制。

13、以上所述的荧光基团可选自fam、hex、texas red、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、lc red640、lc red705中的任一种。

14、在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团为fam。

15、以上所述的用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团优选为c3 spacer。

16、优选地，将距探针5’端的第31个碱基用dspacer替换。

17、以上所述的引物探针组能够高效区分松材线虫与拟松材线虫等非松材线虫，具有较高的特异性，同时，在检测松材线虫时具有较高的灵敏度。

18、第二方面，本发明提供一种松材线虫的检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的特异性引物探针组。

19、为便于检测，除包含以上所述的特异性引物探针组外，所述试剂盒还包含选自raa缓冲液（buffer）、raa扩增反应干粉、醋酸镁、通用核酸检测试纸条中的一种或多种。

20、优选地，所述raa扩增反应干粉包含重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶。

21、优选地，所述通用核酸检测试纸条为胶体金试纸条。

22、所述胶体金试纸条在结合垫上预埋抗荧光素抗体并与胶体金相连；在检测线上预埋链霉亲和素（与生物素特异性结合）；在质控线上预埋二抗，该二抗与抗荧光素抗体特异性结合。当扩增产物添加到样品垫后，向结合垫移动，到达检测线时，生物素与链霉亲和素结合，使检测线显示为红色，当样品到达质控线时，与胶体金相连的抗荧光素抗体与二抗结合，使质控线显示为红色；当质控线显示为红色时表示检测结果可信，质控线不显示红色则为无效结果。

23、第三方面，本发明提供以上所述的特异性引物探针组或所述检测试剂盒在检测松材线虫或制备松材线虫的检测试剂或试剂盒中的应用。

24、优选地，所述应用中，检测松材线虫为检测木屑样品或线虫样品中是否含有松材线虫。

25、第四方面，本发明提供一种松材线虫的raa-lfa检测方法，所述方法包括：以待检测样品的dna为模板，使用以上所述的特异性引物探针组或所述检测试剂盒进行扩增反应，得到扩增产物。

26、优选地，所述扩增反应包括在37℃-40℃条件下反应15-30min。

27、进一步优选地，所述扩增反应包括在37℃-39℃（更优选为37℃）条件下反应15-30min（更优选为20-30min）。

28、优选地，所述扩增反应的体系为20-50μl。

29、以上所述的方法还包括：采用通用核酸检测试纸条对所述扩增产物进行检测，根据检测结果判断所述待检测样品中是否含有松材线虫。

30、优选地，所述待检测样品为线虫样品或木屑样品。

31、以上所述的检测方法仅需要使用恒温水浴在短时间内即可完成检测，通过肉眼观察即可准确、高效、简单地判定样品中是否含有松材线虫。

32、在本发明的一些实施方式中，所述松材线虫的raa-lfa检测方法包括如下步骤：

33、（1）提取待检测样品的dna；

34、（2）以提取的样品dna为模板，使用所述特异性引物探针组建立raa扩增体系并进行扩增反应，得到扩增产物；

35、（3）将扩增产物用试纸条缓冲液稀释后，将试纸条结合垫端插入到装有稀释的扩增产物的反应管中，液面不超过结合垫最上端，待判读区全部浸润（约1-2min），待质控线（c线）显色后，取出试纸条，直接读取检测结果；

36、当检测线与质控线均显示红色时，表明待检测样品中含有松材线虫；当检测线不显示红色，质控线显示红色时，表明待检测样品中不含有松材线虫；当质控线不显示红色时，检测结果无效。

37、本发明的有益效果至少包括：本发明提供了基于raa技术的检测松材线虫的特异性引物探针组，该引物探针组能够特异性扩增松材线虫dna，对于拟松材线虫等近缘种则无法扩增，能够区分松材线虫与其近缘种（拟松材线虫等），具有较高的特异性，同时，在检测松材线虫时具有较高的灵敏度。

38、本发明基于上述引物探针组进一步建立了一种松材线虫的raa-lfa检测方法，该方法能够对木屑等样品中的松材线虫进行快速、准确的检测，不仅特异性高、灵敏度高，而且操作简单，结果直观，为松材线虫病的现场检测和早期诊断提供了有效的技术手段。