一种秦艽VIGS沉默体系的建立方法和应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种秦艽vigs沉默体系的建立方法和应用。

背景技术：

1、秦艽，始载于《神农本草经》，具有祛风除湿，和血舒筋，清热利尿的功效。临床用于治风湿痹痛，筋骨拘挛，黄疸，便血，骨蒸潮热，小儿疳热，小便不利。现代研究表明秦艽中的主要次生代谢产物是以龙胆苦苷为代表的裂环烯醚萜苷类化合物。目前药材市场流通的秦艽分野生和栽培两种资源。野生秦艽被列为国家三级重点保护野生药材，资源较少。而栽培秦艽品质良莠不齐，加之受到生长年限、种植技术、价格波动等因素制约，农户种植积极性普遍不高。因此，一方面需要加快对秦艽药效成分产生机理机制的研究，推动秦艽优良品种的选育。另一方面可以利用生物技术调控手段规模化生产龙胆苦苷等活性成分，突破秦艽资源限制带来的壁垒。然而这些都离不开对秦艽中相关基因功能的研究。

2、目前在高通量测序技术的快速发展下，获得了秦艽的基因组信息和转录组信息，得到了海量的基因数据，但很多与秦艽药效成分积累相关的基因，与品种优良性状有关的基因并不明晰，相应基因功能的研究也相对迟缓，这主要是因为缺乏可以高效快速鉴别基因功能的研究体系，而vigs技术在秦艽中的建立将缩短基因功能的研究周期。vigs(virusinduced gene silencing，病毒诱导的基因沉默)是指将携带目标基因片段的病毒侵染植物，诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。与传统的基因功能分析方法相比具有以下优点：①简单快速。vigs能够在侵染植物后对目标基因进行沉默和功能分析，可以避免植物稳定转化耗时长、繁杂的实验过程；②沉默效率高。因植物病毒具有高效的复制和扩散能力，这样，病毒载体中携带的沉默诱导子(silencinginducer)可以迅速积累并引发基因沉默，从而实现高效的基因沉默效果。且当单链的t-dna进入植物细胞后，其表达不受基因位置和基因沉默的影响，许多未整合到植物基因组中的游离外源基因同样可以表达，因而表达效率也更高。③安全有效。不受植物生长发育过程的影响，不产生可遗传的后代，也不存在基因漂移的风险，结果可靠直观。vigs技术已用于烟草、番茄、喜树、长春花等植物的抗病反应、生长发育以及代谢调控的功能基因研究。但vigs技术未在药用植物秦艽中得到应用。

技术实现思路

1、为了实现高效、快速鉴定秦艽基因功能，本发明以秦艽gmpds为目标干扰基因，提供了一种秦艽vigs沉默体系的建立方法。秦艽vigs沉默gmpds基因后，gmpds基因表达水平降低，类胡萝卜素含量相比对照降低，而作为秦艽中主要药效成分的马钱苷酸和龙胆苦苷的含量都显著高于对照，说明本发明成功干扰了gmpds基因的表达，并获得了相应的性状，说明vigs沉默体系在秦艽中成功建立并应用。此外，本发明使用的ptrv2:egfp载体带有增强型绿色荧光蛋白，若egfp成功表达，则可观察到荧光，说明载体被成功注射到秦艽组织中，使用vigs体系在秦艽中研究基因功能方法可行。该体系为挖掘、验证秦艽重要性状的基因、抗病基因以及生源合成相关酶基因的功能提供技术依据。

2、本发明提供了一种秦艽vigs沉默体系的建立方法，包括如下步骤：

3、s1，pmd19-t-gmpds构建：提取秦艽总rna，反转录得到cdna，以cdna为模板，以gmpds-f和gmpds-r为引物扩增获得gmpds基因的cds全长序列(gmpds的cds全长核苷酸序列如seq id no.9所示)，然后与pmd19-t载体连接，获得质粒pmd19-t-gmpds；

4、s2，ptrv2:egfp-gmpds重组质粒构建：以质粒pmd19-t-gmpds为模板，以gmpds-ptrv2-f和gmpds-ptrv2-r为引物扩增获得gmpds基因片段(gmpds基因片段的核苷酸序列如seq id no.10所示)，然后通过一步克隆法与线性化的ptrv2:egfp载体连接，获得ptrv2:egfp-gmpds重组质粒；

5、所述ptrv2:egfp载体是在ptrv2载体的1053bp位置插入绿色荧光蛋白egfp所得；

6、s3，农杆菌注射法转化秦艽叶片：将ptrv2:egfp-gmpds重组质粒转入gv3101农杆菌感受态，培养后获得菌液，注射法转化秦艽组织。

7、进一步地，s1中，所述gmpds-f引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

8、所述gmpds-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、进一步地，s1中，gmpds基因的cds全长序列扩增体系为：模板cdna 5μl，gmpds-f1.5μl，gmpds-r 1.5μl，premix taqtm酶25μl，ddh2o 17μl。

10、进一步地，s2中，所述gmpds-ptrv2-f引物的核苷酸序列如seq id no.7所示；

11、所述gmpds-ptrv2-r引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。

12、进一步地，s2中，所述gmpds基因片段与线性化的ptrv2:egfp载体连接的反应体系为：gmpds基因片段3μl，线性化的ptrv2载体1μl，2×samless cloning 10μl，nucleasefree water 6μl。

13、进一步地，s3中，注射法转化秦艽叶片中以注射ptrv1+ptrv2:egfp菌液为对照组，注射ptrv1+ptrv2:egfp-gmpds为实验组。

14、进一步地，秦艽vigs沉默体系中gmpds基因表达量降低，类胡萝卜素含量降低。

15、本发明还提供了上述方法建立的秦艽vigs沉默体系在药效成分含量积累中的用途，秦艽vigs沉默gmpds基因的转化体系中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量都显著升高，沉默植株获得了相应的性状。

16、进一步地，所述ptrv2:egfp载体的绿色荧光蛋白egfp，在注射在秦艽组织后可通过荧光观察注射情况及载体的表达情况。

17、进一步地，所述秦艽组织为叶片、果实、花、茎、根或愈伤组织中的任意一种。

18、本发明还提供了一种转基因秦艽的构建方法在药物制备中的应用，利用vigs沉默gmpds基因后，秦艽中的药效成分马钱苷酸和龙胆苦苷的含量升高。vigs沉默gmpds基因使得转基因秦艽药效提高，从而提高了用秦艽制备药物的药效。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、1、本发明利用vigs技术，在秦艽中构建vigs沉默体系，gmpds基因表达分析，发现实验组中秦艽幼苗叶片和秦艽愈伤组织中pds基因表达量均低于对照组，在注射5d、10d、15d实验组中秦艽幼苗叶片中类胡萝卜素含量测定低于对照组，说明vigs体系在秦艽中成功建立，取得了较好的沉默效果。

21、通过检测分析可知，秦艽vigs沉默体系中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量都显著高于空载，在第30天含量有明显的积累，说明秦艽vigs沉默gmpds基因，促使体系的主要有效成分增加，对促进药用植物秦艽次生代谢产物含量的积累具有实际意义。

22、本发明实验周期短，方法简单，成本低，为秦艽基因功能的快速鉴定奠定了良好的基础。

23、2、基于烟草脆裂病毒(trv)构建的vigs体系是目前应用的最为广泛的瞬时沉默系统。该系统依赖阳性对照，即通过干扰植物中与叶绿素、类胡萝卜素合成有关的基因，使被侵染的植物新生叶片表现出白化或黄化效应，以此确定病毒载体是否侵染成功，而病毒载体在不同植株内、不同条件下引发的基因沉默效果可能存在差异，加之不同植物生长周期不同，白化表型出现的时间也可能存在差异，白化现象或许并不明显或未能观察到，而影响后续的实验研究。本发明所用的ptrv2:egfp载体带有增强型绿色荧光蛋白egfp，通过荧光观察设备即可判断载体是否被成功注射到秦艽组织。egfp成功表达，即可观察到荧光，说明载体被成功注射到秦艽组织中，目标载体正常表达，说明病毒载体侵染成功。