减少KASP基因分型非特异扩增的TaqDNA聚合酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和分子诊断领域，具体涉及减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶及其应用。

背景技术：

1、kasp(kompetitive allele specifc pcr)是一种常用于检测单核苷酸多态性(snps)或插入缺失(indels)的技术。kasp基于pcr技术，但其pcr反应体系对扩增靶标的特异性要求更高，kasp需要对单一核苷酸位点的不同类型核苷酸进行区分，且在扩增无核酸水(ntc)时更易产生引物二聚体和非特异性扩增，在核酸样本snps检测更易发生非特异核苷酸位点扩增，ntc扩增引物二聚体和核酸样本扩增非靶标基因片段的产生会导致分型错误，严重影响基因分型的准确性。

2、在pcr反应中，taq dna聚合酶可以从引物延伸获得靶标基因片段，对靶标基因的特异性扩增起着至关重要的作用。但是taq dna聚合酶在pcr反应升温过程中仍然具有聚合酶活性，易产生非特异扩增和引物二聚体，影响靶标基因的扩增。为了提高扩增靶标基因的特异性，可通过抑制taq dna聚合酶在预变性之前的聚合酶活性来达到热启动的目的，化学修饰、抗体修饰、适配体修饰为常见的抑制手段。

3、然而，现有的修饰方法获得的taq dna聚合酶往往存在不耐热、封闭不稳定、制备方法较为复杂(如通常需要经过纯化处理)、耗时耗力的缺点，且通常不能满足kasp对高特异pcr扩增的需求。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，该聚合酶耐热性能好、封闭稳定且能够满足kasp基因分型技术的需求。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，所述聚合酶的制备方法如下：配制taq dna聚合酶马来酸酐化学修饰体系，4±2℃放置1.5～2.5h后离心并用洗涤缓冲液和离心过滤管去除多余的去除马来酸酐，然后将洗涤后的taq聚合酶用50％甘油保存；其中，taq dna聚合酶马来酸酐化学修饰体系由ph8.9 50～150mm tris-hcl、100～200mmkcl、1～3mm edta、0.01～2mm马来酸酐、0.1～2mg/ml taq dna聚合酶和dmf组成；

4、将马来酸酐修饰的taq dna聚合酶甘油溶液与taq抗体按照1:(0.5～3)的质量比混匀后，25±3℃孵育40～70min，即得。

5、作为一种优选的实施方式，所述抗体为单克隆抗体rk20545，浓度为5000u/ml。

6、作为一种优选的实施方式，所述马来酸酐在使用前先用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解。

7、作为一种优选的实施方式，所述洗涤缓冲液由ph 7.5 10～100mm tris-hcl、50～500mm kcl、0.1～2mm edta组成。

8、本发明还提供了上述taq dna聚合酶在kasp基因分型技术中的应用。

9、本发明还提供了上述taq dna聚合酶在不同类型dna/rnapcr或qpcr检测中的应用。

10、本发明还提供了上述taq dna聚合酶在制备kasp基因分型检测试剂盒中的应用。

11、本发明还提供了上述taq dna聚合酶在制备snp检测试剂盒中的应用。

12、与现有技术相比，本发明的核心效果在于：

13、(1)kasp反应条件的循环数一般不超过40个循环，超过40个循环极易发生非特异扩增，采用本发明所述方法获得的启动taq dna聚合酶即便是在37℃放置7天，采用45个循环进行测试，ntc检测依然不发生非特异扩增和引物二聚体，且基因分型效果良好，封闭稳定，能够明显改善taq dna聚合酶不耐热、封闭不稳定的缺点，提高kasp基因分型的准确性；

14、(2)制备工艺简单，时间短，无需经过纯化等步骤，整个制备过程仅需要5～6小时就可以完成。

技术特征：

1.一种减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，其特征在于，所述聚合酶的制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体rk20545。

3.根据权利要求1所述的减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，其特征在于，所述马来酸酐在使用前先用n,n-二甲基甲酰胺溶解。

4.根据权利要求1所述的减少kasp基因分型非特异扩增的taq dna聚合酶，其特征在于，所述洗涤缓冲液由ph 7.5 10～100mm tris-hcl、50～500mm kcl、0.1～2mm edta组成。

5.权利要求1～4任一项所述的taq dna聚合酶在kasp基因分型技术中的应用。

6.权利要求1～4任一项所述的taq dna聚合酶在不同类型dna/rna pcr或qpcr检测中的应用。

7.权利要求1～4任一项所述的taq dna聚合酶在制备kasp基因分型检测试剂盒中的应用。

8.权利要求1～4任一项所述的taq dna聚合酶在制备snp检测试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术和分子诊断领域，具体涉及减少KASP基因分型非特异扩增的Taq DNA聚合酶，所述聚合酶的制备方法如下：配制Taq DNA聚合酶马来酸酐化学修饰体系，4±2℃放置1.5～2.5h后离心并用洗涤缓冲液去除马来酸酐，然后将洗涤后的Taq聚合酶用50％甘油保存；其中，Taq DNA聚合酶马来酸酐化学修饰体系由pH8.9 50～150mM Tris‑HCl、100～200mM KCl、1～3mM EDTA、0.01～2mM马来酸酐、0.1～2mg/mL Taq DNA聚合酶和DMF组成；将马来酸酐修饰的Taq DNA聚合酶甘油溶液与Taq抗体按照1:(0.5～3)的质量比混匀后，25±3℃孵育40～70min，即得。该聚合酶能够明显改善Taq DNA聚合酶不耐热、封闭不稳定的缺点，且能提高KASP基因分型的准确性，整个制备过程也仅需5～6小时就可以完成。

技术研发人员：冯延叶,敖莉丝,张书祖,赖煦卉
受保护的技术使用者：上海英基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10