宫颈癌SOX1-SEPTIN9-ZIC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒的制作方法

本发明涉及基因诊断的，尤其是涉及一种宫颈癌sox1-septin9-zic1基因甲基化的检测试剂及试剂盒。

背景技术：

1、宫颈癌是女性特有的一种恶性肿瘤，该疾病在女性中的发病率仅次于乳腺癌，据统计，全球每年约20多万女性因宫颈癌死亡。宫颈癌按病理分类可分为宫颈鳞状细胞癌、宫颈腺癌、宫颈腺鳞癌3种，其中以宫颈鳞状细胞癌最为常见，宫颈癌患者普遍存在阴道不规则出血、接触性出血、白带异常、下腹部疼痛等（早期不显著）症状，随着病程延长，多数患者还会合并输尿管梗阻、肾积水、尿毒症等并发症。宫颈上皮内病变是宫颈癌前病变最具代表性的表现，其症状与早期宫颈癌类似，二者鉴别难度相对较大。

2、甲基化肿瘤标志物作为一种创新的检测技术，是癌症早筛的理想标志物。尽管现有技术中已经发现了一些甲基化肿瘤标志物，但是其受限于甲基化肿瘤标志物的检测试剂或者检测手段，导致肿瘤标志物的灵敏度和特异性不能满足需求。

3、因此，如何提高肿瘤标志物检测的灵敏度和特异性，成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种宫颈癌sox1-septin9-zic1基因甲基化的检测试剂及试剂盒。

2、本发明首次发现sox1-septin9-zic1基因进行甲基化联合检测，可以实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及其癌前病变进行检测。

3、第一方面，本技术提供一种引物，采用如下的技术方案：

4、一种引物，所述引物选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：22、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：28、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：32、seq id no：43、seq id no：44、seq id no：46、seq id no：47、seq id no：49、seq id no：50所示氨基酸序列，或与其具有至少80％以上的同源性的氨基酸序列。

5、优选的，所述引物选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：22、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：28、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：32、seq id no：43、seq id no：44、seq id no：46、seq id no：47、seq id no：49、seq id no：50所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。

6、优选的，所述引物选自seq id no：1和seq id no：2、seq id no：4和seq id no：5、seq id no：7和seq id no：8、seq id no：22和seq id no：23、seq id no：25和seq id no：26、seq id no：28和seq id no：29、seq id no：31和seq id no：32、seq id no：43和seq idno：44、seq id no：46和seq id no：47、seq id no：49和seq id no：50所示的至少一对引物对。

7、更优选的，所述引物选自seq id no：1和seq id no：2、seq id no：22和seq idno：23、seq id no：43和seq id no：44所示的引物对。

8、第二方面，本技术提供一种探针，采用如下的技术方案：

9、一种探针，包括针对sox1基因、septin9基因、zic1基因检测的探针；

10、所述探针选自seq id no：3、seq id no：6、seq id no：9、seq id no：24、seq idno：27、seq id no：30、seq id no：33、seq id no：45、seq id no：48、seq id no：51所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。

11、优选的，所述探针选自seq id no：3、seq id no：24、seq id no：45所示的序列。

12、优选的，在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团。

13、优选的，荧光淬灭基团为bhq、bhq1、bhq2、tamra或mgb，荧光报告基团为fam、cy3、cy5、hex、rox或tet。

14、更优选的，荧光淬灭基团为bhq1，荧光报告基团为fam。

15、第三方面，本技术提供上述引物和/或探针在制备宫颈癌检测试剂或试剂盒中的应用，采用如下的技术方案：

16、一种上述引物、上述探针在制备宫颈癌检测试剂或试剂盒中的应用。

17、优选的，所述检测试剂或试剂盒用于检测sox1-septin9-zic1基因经转化试剂修饰后的序列。

18、优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。

19、更优选的，转化试剂为重亚硫酸盐。

20、第四方面，本技术提供一种宫颈癌的检测试剂，采用如下的技术方案：

21、一种宫颈癌的检测试剂，包括上述的引物、上述探针。

22、优选的，所述检测试剂还包括dntps、dna聚合酶、缓冲液、无核酸酶水中的一种或几种。

23、优选的，所述检测试剂还包括内参基因的检测试剂。

24、优选的，内参基因为β-actin或col2a1；进一步的，内参基因也可以采用现有技术的其他的甲基化检测的内参基因。

25、优选的，内参基因为β-actin。

26、优选的，内参基因β-actin检测试剂含有针对内参基因检测的引物对和探针。

27、优选的，内参基因β-actin检测试剂的引物对为seq id no：58和seq id no：59，探针为seq id no：60。

28、优选的，所述检测试剂的检测区域为sox1基因基因体或者其启动子区域、septin9基因基因体或者其启动子区域、zic1基因基因体或者其启动子区域，具体如下：

29、所述检测试剂针对sox1基因的检测区域为seq id no：61或seq id no：62所示的序列；更优选的，所述检测试剂针对sox1基因的检测区域为seq id no：61所示的序列。

30、优选的，所述检测试剂针对septin9基因的检测区域为seq id no：63或seq idno：64所示的序列；更优选的，所述检测试剂针对septin9基因的检测区域为seq id no：63所示的序列。

31、优选的，所述检测试剂针对zic1基因的检测区域为seq id no：65或seq id no：66所示的序列；更优选的，所述检测试剂针对zic1基因的检测区域为seq id no：65所示的序列。

32、在一个具体的可实施方案中，本技术提供一种宫颈癌的检测试剂，包括引物探针组合，采用如下的技术方案：

33、一种宫颈癌的检测试剂，包括针对sox1基因、septin9基因、zic1基因检测的引物对和探针；

34、针对sox1基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：

35、组一：

36、引物对为seq id no：1和seq id no：2，探针为seq id no：3；

37、组二：

38、引物对为seq id no：4和seq id no：5，探针为seq id no：6；

39、组三：

40、引物对为seq id no：7和seq id no：8，探针为seq id no：9。

41、优选的，针对sox1基因检测的引物对和探针为：

42、组一：引物对为seq id no：1和seq id no：2，探针为seq id no：3。

43、针对septin9基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：

44、组四：

45、引物对为seq id no：22和seq id no：23，探针为seq id no：24；

46、组五：

47、引物对为seq id no：25和seq id no：26，探针为seq id no：27；

48、组六：

49、引物对为seq id no：28和seq id no：29，探针为seq id no：30；

50、组七：

51、引物对为seq id no：31和seq id no：32，探针为seq id no：33。

52、优选的，检测septin9基因检测的引物对和探针：

53、组四：引物对为seq id no：22和seq id no：23，探针为seq id no：24。

54、针对zic1基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：

55、组八：

56、引物对为seq id no：43和seq id no：44，探针为seq id no：45；

57、组九：

58、引物对为seq id no：46和seq id no：47，探针为seq id no：48；

59、组十：

60、引物对为seq id no：49和seq id no：50，探针为seq id no：51。

61、优选的，针对zic1基因检测的引物对和探针：

62、组八：引物对为seq id no：43和seq id no：44，探针为seq id no：45。

63、第五方面，本技术提供一种宫颈癌的检测试剂盒，采用如下的技术方案：

64、一种宫颈癌的检测试剂盒，包括上述的引物或上述探针或上述的检测试剂。

65、第六方面，本技术提供一种用于sox1-septin9-zic1基因甲基化检测方法，采用如下的技术方案：

66、一种用于sox1-septin9-zic1基因甲基化检测方法，所述方法包括使用上述引物、上述探针或上述检测试剂或上述试剂盒进行检测，所述方法不用于疾病诊断和治疗目的。

67、优选的，一种用于sox1-septin9-zic1基因甲基化检测方法，所述检测方法的步骤如下：

68、s1、将待测样品提取dna后，用转化试剂进行处理，获得经修饰的待测样品；

69、s2、利用上述引物、上述探针或检测试剂或试剂盒，对转化试剂修饰后的待测样品进行sox1-septin9-zic1甲基化情况检测。

70、优选的，对步骤s2获取的检测△ct值与临界值进行比较分析，当△ct值小于临界值时为阳性，表明收集的待测样品中含有甲基化的sox1基因、septin9基因、zic1基因中的至少一种。

71、优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。

72、更优选的，转化试剂为重亚硫酸盐。

73、第七方面，本技术提供一种宫颈癌的诊断系统，采用如下的技术方案：

74、一种宫颈癌的诊断系统，所述诊断系统含有：

75、a.检测构件：用以定量检测sox1-septin9-zic1基因的dna甲基化程度的检测构件；

76、b.结果判断构件。

77、优选的，用于根据检测构件检测的定量检测sox1-septin9-zic1基因的dna甲基化程度结果，输出宫颈癌的患病的可能性或者风险值。

78、优选的，所述的定量检测sox1-septin9-zic1基因的dna甲基化程度的检测构件含有上述引物、上述探针或检测试剂或试剂盒。

79、优选的，所述的患病风险是根据通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。

80、发明人经过深入的研究，首次揭示一种宫颈癌sox1-septin9- zic1基因甲基化的检测试剂及试剂盒，所述的甲基化dna位于人sox1基因及其启动子区域、septin9基因及其启动子区域和zic1基因及其启动子区域。本发明人不仅在组织样本中验证了sox1、septin9、zic1基因的检出率，同时验证了sox1、septin9、zic1基因在tct样本中具有同样高的特异性和灵敏性，并且通过对sox1、septin9、zic1基因组合，可以明显提高宫颈癌的检出率。本发明人还通过对sox1、septin9、zic1基因进行引探的优化，进一步提高了检测性能。在此基础上完成了本发明。

81、发明人经过检索和查阅大量文献以及对the cancer genome atlas（tcga）平台的数据分析，并且基于reduced representation bisulfite sequencing（rrbs）高通量二代测序的甲基化dna检测技术，对宫颈石蜡样本进行检测及深入分析，获取宫颈癌及癌前病变具有临床诊断意义的标志物，同时采用qpcr方法先后经过宫颈石蜡样本以及tct宫颈脱落细胞样本进行验证，最终发现sox1基因、septin9基因、zic1基因这3个基因进行联合检测，实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及癌前病变患者进行识别。

82、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

83、本技术公开了一种宫颈癌sox1-septin9-zic1基因甲基化的检测试剂及试剂盒，不仅在组织样本中验证了sox1基因、septin9基因、zic1基因的检出率，同时验证了sox1基因、septin9基因、zic1基因在tct样本中具有同样高的特异性和灵敏性，并且通过对sox1、septin9、zic1基因组合，可以明显提高宫颈癌的检出率；尤其是针对鳞状上皮内病变（hsil）的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。