先导编辑系统及其应用的制作方法

本发明大体涉及生物医学，具体而言，涉及一种先导编辑系统及其应用。

背景技术：

1、先导编辑器（prime editor, pe）是最为先进的二代crispr/cas9基因组编辑技术之一，可实现任意类型的单碱基替换以及短dna片段的插入和删除。典型的先导编辑器由cas9-h840a突变体、mmlv逆转录酶以及提供引物和模板的pegrna组成，其中cas9负责介导双链dna的解链和非靶向链的切割，进而诱导结合引物的产生，随后pegrna中的pbs（primebinding sequence）与引物结合，并借由逆转录酶的作用引导pcr产物的生成，最后经过真核细胞的dna修复机制插入目的突变。目前pe已经由最初的pe2/3发展至现有的pe6版本，pe3相较于pe2引入了一条引导靶向链切割的grna，可促进编辑效率的提升(anzalone, a.v., et al. (2019). "search-and-replace genome editing without double-strandbreaks or donor dna." nature 576(7785): 149-157.)（图1）；pe4/5在既往基础上引入了抑制细胞mmr（mismatch repair）修复的负向调控因子mlh1dn，进一步优化现有pe的编辑效率(chen, p. j., et al. (2021). "enhanced prime editing systems bymanipulating cellular determinants of editing outcomes." cell 184(22): 5635-5652.e5629.)；pe6将mmlv替换至高效率的小体积逆转录酶，并通过cas9的突变实现pe的再优化(doman, j. l., et al. (2023). "phage-assisted evolution and proteinengineering yield compact, efficient prime editors." cell 186(18): 3983-4002.e3926.)。虽然pe的编辑效率已经实现大幅提升，但pe技术仍存在诸多局限性。

技术实现思路

1、本发明的第一方面在于提供一种融合蛋白，包含cas9切口酶，以及逆转录酶，且所述cas9切口酶仅切割目的dna的靶向链。

2、本发明的第二方面在于提供一种先导编辑系统，其为组合物或复合物，包含第一方面所述的融合蛋白，以及配合所述融合蛋白实现先导编辑功能的逆向pegrna；

3、所述逆向pegrna的引物结合序列与靶向链切口处3’端dna链的至少部分序列互补，逆转录模板序列基于靶向的grna进行设计。

4、本发明的第三方面在于提供一种核酸构建体，其编码第一方面所述的融合蛋白，和/或第二方面中所提及的逆向pegrna。

5、本发明的第四方面在于提供一种载体，其包含第三方面所述的核酸构建体。

6、本发明的第五方面在于提供一种递送系统，其包含i) 第二方面所述的先导编辑系统，以及ii）递送媒介物。

7、本发明的第六方面在于提供一种药物组合物，其包含第五方面所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。

8、本发明的第七方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统的以下至少一项应用：

9、a) 用于生物体或生物细胞基因组序列的编辑；

10、b) 用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

11、c) 用于提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；

12、d) 用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品；

13、e) 通过在蛋白质中引入不同的突变构建文库，以筛选实现蛋白质的定向进化。

14、本发明的第八方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统在制备诱导通用型的用于过继免疫细胞疗法的肿瘤杀伤细胞中的应用。

15、本发明的第七方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。

16、发明人意外的发现，通过替换仅切割目的dna靶向链的cas9切口酶，构建得到的逆向先导编辑系统（rpe）能够特异性编辑切口处5’端dna链的编辑，从而实现了显著降低的脱靶效应，同时进一步降低了潜在的indel副产物比例。

技术特征：

1.一种融合蛋白，其特征在于，包含cas9切口酶以及逆转录酶，且所述cas9切口酶仅切割目的dna的靶向链。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述逆转录酶位于所述cas9切口酶的n端。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述cas9切口酶为d10a。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述逆转录酶为mmlv或其具有逆转录酶活性的截短体。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述mmlv具有d200n、l603w、t330p、t306k、w313f突变。

6.先导编辑系统，其特征在于，为组合物或复合物，包含权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，以及配合所述融合蛋白实现先导编辑功能的逆向pegrna；

7.核酸构建体，其特征在于，编码权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，和/或权利要求6中所提及的逆向pegrna。

8.载体，其特征在于，包含权利要求7所述的核酸构建体。

9.递送系统，其特征在于，包含i) 权利要求6所述的先导编辑系统，以及ii）递送媒介物。

10.药物组合物，其特征在于，包含权利要求9所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。

11.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，或权利要求6所述的先导编辑系统，或权利要求7所述的核酸构建体，或权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的递送系统的以下至少一项应用：

12.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，或权利要求6所述的先导编辑系统，或权利要求7所述的核酸构建体，或权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的递送系统在制备诱导通用型的用于过继免疫细胞疗法的肿瘤杀伤细胞中的应用。

13.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，或权利要求6所述的先导编辑系统，或权利要求7所述的核酸构建体，或权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。

技术总结
本发明大体涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种先导编辑系统及其应用。该先导编辑系统为组合物或复合物，包含融合蛋白，以及配合所述融合蛋白实现先导编辑功能的逆向pegRNA；该融合蛋白包含Cas9切口酶以及逆转录酶，且所述Cas9切口酶仅切割目的DNA的靶向链。

技术研发人员：杨超,郝继辉,余俊
受保护的技术使用者：深锐（天津）生物医学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21