一种利用OTARMS系统特异性扩增靶标基因的引物对和方法与流程

本发明属于生物，具体地说，本发明涉及一种基因扩增方法，特别涉及一种利用otarms系统特异性扩增靶标基因的引物对和方法。

背景技术：

1、基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息核酸序列通过复制将遗传信息传递至下一代，并通过指导蛋白质的合成来控制生物个体的性状表达。基因检测技术是通过血液、组织或其它携带核酸的样本对dna或rna进行检测的技术，是通过对受检样本中的核酸进行扩增放大并通过特定的方式或者特定设备对核酸信息进行显示的一种技术。在实际应用中，常需要对某个位点的核酸进行碱基鉴别或区别扩增(如snp位点)。如果需要鉴别或者区别扩增靶标序列，但在受检样本中存在与待检序列相似，甚至高度相似的序列时，会给实际检测带来不了的挑战，尤其是仅有少数甚至几个碱基不一致的序列时，更是难以区别扩增。

2、因此，设计一个简单易用、成本低廉、能精确识别单一位点差异的不同序列的检测系统很有必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种利用otarms(openterminal amplification refractory mutation system，开放末端扩增阻滞突变系统)系统特异性扩增靶标基因的引物对和方法。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：一种特异性扩增靶标基因的引物对，包括第一引物和配对使用的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物由第一部分和第二部分构成，其中：第一部分与靶标基因互补结合，该部分可以引导碱基合成，引发模板扩增；第二部分为开放末端，不能与靶标基因形成互补片段，第一部分和第二部分从第2个扩增循环时作为一个整体引物与首次扩增产物退火形成完全互补的片段，扩增阻滞引物与首次扩增产物间的结合力＞第一部分和靶标基因间的结合力。

4、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分的长度为13～23个碱基。

5、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端设置在靶标基因与非靶标基因碱基不一致的位置。

6、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端往5’端方向的第2～5碱基的位置引入至少1个与靶标基因和非靶标基因碱基均不同的碱基。

7、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端往5’端方向的第2～5碱基的位置引入1～3个、1或2个与靶标基因和非靶标基因碱基均不同的碱基。

8、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分的长度为13～23个碱基，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端设置在靶标基因与非靶标基因碱基不一致的位置。

9、在一些引物对的实例中，所述与靶标基因和非靶标基因碱基均不同的碱基为c。

10、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第二部分的长度为6～15个碱基。

11、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第二部分平衡靶标片段的gc含量。

12、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第一部分与靶标基因结合引发模板扩增的温度为56～66 ℃。

13、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第二部分的长度为6～15个碱基，所述扩增阻滞引物第二部分平衡靶标片段的gc含量。

14、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第二部分的长度为6～15个碱基，所述扩增阻滞引物第一部分与靶标基因结合引发模板扩增的温度为56～66 ℃。

15、在一些引物对的实例中，所述扩增阻滞引物第二部分的长度为6～15个碱基，所述扩增阻滞引物第二部分平衡靶标片段的gc含量，所述扩增阻滞引物第一部分与靶标基因结合引发模板扩增的温度为56～66 ℃。

16、在一些引物对的实例中，所述第一引物同样具有所述扩增阻滞引物的特征。

17、上述各技术特征在不冲突的情况下，可以任意组合。

18、本发明的第二个方面，提供：一种利用开放末端扩增阻滞突变系统特异性扩增靶标基因的方法，包括如下步骤：

19、s1)提取获得待测基因模板；

20、s2)在模板中加入本发明第一个方面所述的引物对，扩增得到靶标基因。

21、本发明的有益效果是：

22、本发明一些实例的引物组，其中的扩增阻滞引物能够特异性结合靶标基因完成延伸扩增的同时，具备阻滞突变序列或非靶标序列扩增的能力，实现高度近似基因，如snp的高效特异性扩增。

23、本发明一些实例的引物组，扩增阻滞引物(otarms引物)第二部分的引入使得扩增引物和扩增的产物的结合力大大提升，且扩增引物与突变基因或非靶标基因存在≥1、2个碱基的差异，在较高的温度下，扩增引物和靶标的产物能正常退火互补并引发延伸，而扩增引物与突变基因或非靶标基因结合的可能性大大降低，达到了进一步阻滞突变基因或非靶标基因扩增的目的。

24、本发明一些实例的引物组，扩增阻滞引物引入的开放性序列，在后续的扩增中逐渐变成主要的扩增模版，而otarms引物与含有开放性序列的模版能够完全匹配，完全匹配模版的引物的扩增效率增加，即本系统即保证了前期的循环能够阻滞突变基因或非靶标基因序列的扩增，在保证特异性序列有绝对性的优势之后，启用另外一套引发扩增的序列引物，这样使得能在后面的扩增中以更高的效率完成靶标模版扩增。

25、本发明一些实例的引物组，引物同时具备开放性序列及开放性的设计，因此能非常方便的应用于不同的技术平台，包含以下平台和检测方法，但不限于以下平台和检测方法：

26、1）高通量测序平台，通过开放端的设计，将序列设置为与测序使用接头或通用的扩增引物互补，即可无需进行末端修复加“a”、加“接头”等多个步骤，仅通过pcr扩增就能引入测序相关接头或通用的扩增引物即能构建出来完整的文库结构。

27、2）在qpcr检测平台用以定性检测：在扩增体系中加入荧光燃料或荧光探针即可进行实时荧光检测。

28、3）在qpcr检测平台用以定量检测：在扩增体系中加入内标基因扩增系统，即可通过检测靶标与内标基因的比值确定检测靶标是单拷贝还是双拷贝。结果可通过荧光燃料或荧光探针进行报告。

29、4）在pcr检测方法中，本发明的扩增系统扩增结束后，可以通过琼脂糖凝胶电泳进行结果报告，待检物中含有靶标基因时，琼脂糖凝胶电泳有相对应大小的条带，若待检物中不含有靶标基因时，琼脂糖凝胶电泳则没有相对应大小的条带；该结果也可以通过sanger测序进行结果报告。

技术特征：

1.一种特异性扩增靶标基因的引物对，包括第一引物和配对使用的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物由第一部分和第二部分构成，其中：第一部分与靶标基因互补结合，该部分可以引导碱基合成，引发模板扩增；第二部分为开放末端，不能与靶标基因形成互补片段，第一部分和第二部分从第2个扩增循环时作为一个整体引物与首次扩增产物退火形成完全互补的片段，扩增阻滞引物与首次扩增产物间的结合力＞第一部分和靶标基因间的结合力。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第一部分的长度为13～23个碱基。

3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端设置在靶标基因与非靶标基因碱基不一致的位置。

4.根据权利要求1～3任一项所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第一部分的3’端往5’端方向的第2～5碱基的位置引入至少1个与靶标基因和非靶标基因碱基均不同的碱基。

5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述与靶标基因和非靶标基因碱基均不同的碱基为c。

6.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第二部分的长度为6～15个碱基。

7.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第二部分平衡靶标片段的gc含量。

8.根据权利要求1、6或7所述的引物对，其特征在于，所述扩增阻滞引物第一部分与靶标基因结合引发模板扩增的温度为56～66 ℃。

9.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述第一引物同样具有所述扩增阻滞引物的特征。

10.一种利用开放末端扩增阻滞突变系统特异性扩增靶标基因的方法，包括如下步骤：

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种利用OTARMS系统特异性扩增靶标基因的引物对和方法。引物对包括第一引物和配对使用的扩增阻滞引物，扩增阻滞引物的第一部分与靶标基因互补结合，第二部分为开放末端。扩增阻滞引物从第2个扩增循环时作为一个整体引物与首次扩增产物退火形成完全互补的片段，扩增阻滞引物与首次扩增产物间的结合力＞第一部分和靶标基因间的结合力。扩增阻滞引物能够特异性结合靶标基因完成延伸扩增，阻滞突变序列或非靶标序列扩增，实现高度近似基因的高效特异性扩增。扩增阻滞引物第二部分的引入使得扩增引物和扩增的产物的结合力大大提升，进一步保证了扩增的特异性。

技术研发人员：李胜,蒋馥蔓,曾晓静,陈昊,杜伯乐,王阳,郭宇来,李小坤
受保护的技术使用者：深圳精科生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22