本发明属于微生物细胞，尤其涉及一种kras突变的小鼠胆管癌细胞系及其建立方法和应用。
背景技术：
1、胆管癌(biliary tract cancers，btcs)起源于胆囊、肝内胆管和肝外(肝门周围和远端)胆管，主要包括胆囊癌(gallbladder cancer，gbc)、肝内胆管癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，icc)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ecc)。胆管癌发病率不高，约占所有消化系统肿瘤的3％，绝大部分为腺癌，其侵袭性强，术后易复发，预后极差，5年生存率低于5％，被誉为新的“癌中之王”。
2、手术切除是目前治疗胆管癌的首选方法。然而，完全切除(complete resection，r0)在不同类型之间有所不同。ecc比icc有更低的概率达到r0。一般来说，ecc患者的5年生存率为11～31％，相比于icc患者的5年生存率(14～34％)更低，这取决于是否存在血管侵犯、淋巴结转移和其他转移。据统计，在icc和ecc诊断时，因为局部浸润和转移的存在，只有三分之一的患者符合肿瘤切除的条件。相同的，gbc(gallbladder cancer)是胆道中最常见的肿瘤，占胆管癌的80％～95％，预后也极差，并常伴有肝脏播散和淋巴结转移。
3、总的来说，胆管癌的发生、发展和转移的分子机制，尤其在肿瘤细胞与肿瘤微环境(tme)的相互作用方面，研究人员仍然知之甚少，有待进一步探索。近年来，随着基因测序等技术的发展，对于胆道系统肿瘤特异性突变和驱动基因的认识也逐步深入。据统计在胆管癌中有高达20％～30％患者存在kras突变，且越来越多的研究表明kras突变是胆管癌患者的不良预后因素之一。因此，探究胆管癌的致癌基因并进行相关机制研究，以及探讨肿瘤转移机制，寻找转移相关的靶点和药物，有效抑制肿瘤转移，对于改善治疗和提高胆管癌患者的5年生存率具有重要意义。
4、专利cn117106721a公开了一种小鼠肝内胆管癌细胞系miccn-4及其建立方法和应用，然而该专利的细胞系为肝内胆管癌，仅适用于肝内胆管癌相关研究，无法构建胆囊癌和肝外胆管癌的模型。而且该专利的细胞系不涉及kras突变，也无法进行kras突变的胆管癌的机制研究。
5、因此，开发一种鼠源的kras突变的胆管癌细胞系，可直接用于多种小鼠胆管癌体内模型的构建和胆管癌体外机制的研究，具有非常重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种kras突变的小鼠胆管癌细胞系及其建立方法和应用，可直接用于体内小鼠胆管癌模型的构建和胆管癌体外机制的研究。
2、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01(mus musculus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202405，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日2024年1月23日。
4、所述小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01携带有kras突变。
5、第二方面，本发明提供了上述小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01的建立方法，包括以下步骤：
6、选取4～6周b6-kras-lsl-g12d纯合子小鼠，尾静脉注射以血清型9型的aav为载体的pav-ck19-cre包装病毒，4～5周后选取胆道肿瘤小鼠取出肿瘤组织，通过石蜡切片分析确认为胆管癌后，将肿瘤组织，洗涤、切碎，在含有抗生素，1mg/ml胶原酶i和1％牛血清白蛋白(bsa)的缓冲液中，37℃消化45分钟，消化后的组织过滤去除未消化的部分，剩余的悬浮液离心，得到原代肿瘤细胞；
7、将原代肿瘤细胞重悬于含有1％双抗和20％ fbs的1640培养基中，过滤，离心，重悬，并将其移植于培养皿上继续培养，每两天传代一次，得到小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01。
8、其中，所述缓冲液中，抗生素的浓度为2.5mg/ml两性霉素(fungizone)，50mg/ml庆大霉素(gentamicin)，1％青霉素/链霉素(pen/strep)。
9、所述重悬和所述传代所用的培养基均为含有1％双抗和20％fbs的1640培养基。
10、所述双抗为青霉素-链霉素溶液。
11、第三方面，本发明提供了上述小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01的应用，所述应用选自下列任一种：
12、(1)在体外作为基因编辑工具，研究胆道系统肿瘤的形成原因，影响因素；
13、(2)作为实验工具，进行胆道系统肿瘤的治疗药物筛选；
14、(3)在体内构建胆道系统肿瘤小鼠模型，可用于体内筛选治疗药物和疗法、研究肿瘤进程和转移机制等。
15、所述胆道系统肿瘤是兼具多个特征(肝内，肝外、胆囊)的胆道系统肿瘤。
16、特别的，所述胆道系统肿瘤为kras突变的胆道系统肿瘤。
17、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
18、(1)本发明利用aav包装病毒系统(pav-ck19-cre)诱发了携带kras突变基因小鼠的胆管癌，从而获得了kras突变的小鼠胆管癌细胞系mbtc-k01，填补了目前国内胆管癌研究缺乏稳定免疫健全胆管癌小鼠体内模型的空白，且相比之前报道的少数小鼠肝内胆管癌细胞系，本发明设计的含ck19启动子的病毒靶向胆管组织，产生的肿瘤部位不限于肝内胆管癌，具备多个特征，包括肝内，肝外、胆囊等，具有更广泛的使用意义。
19、(2)本发明提供的细胞系具有更广泛的胆管癌特征，并携带kras突变特征，可用于kras突变胆道系统肿瘤的相关机制研究，该细胞系传代稳定，通过1640培养基即可稳定传代，可直接用于体内小鼠胆管癌模型的构建。
20、(3)本发明提供的细胞系可用作为研究癌症成因的工具，还可以用作筛选治疗癌症药物的工具。
1.一种小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01，其特征在于，所述小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01(mus musculus)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202405，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日2024年1月23日。
2.如权利要求1所述的小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01，其特征在于，所述小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01携带有kras突变。
3.如权利要求1或2所述的小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液中，抗生素的浓度为2.5mg/ml两性霉素，50mg/ml庆大霉素，1％青霉素/链霉素。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重悬和所述传代所用的培养基均为含有1％双抗和20％fbs的1640培养基。
6.如权利要求1或2所述的小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01在研究胆道系统肿瘤中的应用。
7.如权利要求1或2所述的小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01在筛选胆道系统肿瘤的治疗药物中的应用。
8.如权利要求1或2所述的小鼠胆道系统肿瘤细胞系mbtc-k01在构建胆道系统肿瘤小鼠模型中的应用。