一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途的制作方法

本发明涉及医学诊断领域，特别是涉及一种检测2019-ncov的crispr试剂及其在制备检测2019-ncov的试剂盒中的用途等。

背景技术：

1、冠状病毒是一个大型rna病毒家族

2、 而现有技术中，核酸检测试剂盒通常为荧光定量pcr检测与测序检测方法。然而，这些技术仍具有诸多不足之处：1.pcr技术需要精确的温度系统控制，在一些不发达地区无法实现；2.检测灵敏度和特异性仍需进一步提高；3.pcr技术只能用于dna片段检测，rna片段需要提前加入一步逆转录的过程，操作复杂，而且开管操作容易造成样品污染。可见，这些检测方法对实验仪器，检测人员，检测场所有限制。

3、聚合酶扩增(rpa)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和具有链置换功能的dna聚合酶，在恒定温度下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量pcr(qpcr)检测方式，其并没有实质性的灵敏度提升。

4、cas蛋白是来源于古菌和细菌的利用crispr-cas系统抵御外源dna浸染的蛋白，包括cas9，cpf1，c2c1，c2c2(cas13a)等，它们都是由向导rna介导的切割目标dna的dna核酸内切酶。cas9和cpf1已成功开发为重要的基因编辑工具，它们可作为开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的巧妙工具。cas13a是vi型crispr-cas系统效应蛋白，具有rna介导的rna酶切活性，是目前第二大类crispr-cas系统发现的唯一能够降解rna的蛋白。cas13a蛋白在crrna的引导下，靶向目标序列后可启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入biotin与fam标记的rna报告分子,正常情况下完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的报告分子可以被检测到。但目前并未将该技术应用到对2019-ncov的检测。

技术实现思路

1、本发明发现，基于crispr分子诊断技术，通过rpa-crispr的偶联，能够实现“序列扩增”(rpa完成)加上“酶促级联”(cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019-ncov进行检测。因此，

2、本发明提供一种检测2019-ncov的crispr试剂，其中，所述crispr试剂包括rpa扩增引物对及对应的crrna。

3、优选的，所述crrna包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为rpa扩增引物对的扩增序列。

4、优选的，所述引物对扩增2019-ncov的核酸序列。更优选的，所述2019-ncov的核酸序列包括核酸蛋白n和/或棘突糖蛋白s的转录核酸。更优选的，所述2019新型冠状病毒核酸蛋白n的转录核酸序列如seq id no：3或6所示，和/或所述棘突糖蛋白s的转录核酸序列如seq id no：9、12或15任意一个或者多个所示。

5、优选的，所述引物对包含seq id no：1和2；seq id no：4和5，seq id no,7和8；seqid no：10和11；或者seq id no：13和14任意引物对，更优选的，所述引物对如seq id no：1和2；seq id no：4和5，seq id no,7和8；seq id no：10和11；或者seq idno：13和14任意一对或多对引物对所示。

6、优选的，所述锚定序列与cas蛋白特异性识别。更为优选的，所述锚定序列包含富含尿嘧啶的茎环结构。

7、优选的，所述锚定序列如seq id no：21、47和48任意所示。

8、优选的，所述cas蛋白为cas13a蛋白，cas13a蛋白可以来自不同细菌，包括leptotrichia shahii(lshcas13a)，leptotrichia buccalis(lbucas13a)，leptotrichiawadei(lwcas13a)等。更为优选的，所述cas13a蛋白为lwcas13a或lbucas13a。

9、cas13a的激活需要锚定序列、向导序列、靶序列的共同参与，即，当向导序列靶向到rna目标时，与至少20个碱基的crrna的锚定序列共同作用，通过富含尿嘧啶的茎环结构与cas13a分子相互作用，并通过cas13a的一系列构象变化转入一种酶促激活状态。而cas13a蛋白一旦激活，它将结合并切割其他的rna，而不管它们是否与crrna的靶向序列同源。这一点与其他cas蛋白截然不同，这也是选择cas13a作为该功能蛋白的原因。

10、优选的，所述向导序列为核酸蛋白n或者棘突糖蛋白s相匹配的序列，优选的，向导序列为核酸蛋白n相匹配的序列，更优选的，所述向导序列匹配的靶向序列包括seq id no：3、6、9、12和/或15任意一个或者多个序列。

11、优选的，所述向导序列如seq id no：22-26任意序列所示。

12、优选的，所述crrna为上述锚定序列和上述向导序列任意的组合，例如seq id no：21与seq id no：22-26任意序列的组合；seq id no：47与seq id no：22-26任意序列的组合；seq id no：48与seq id no：22-26任意序列的组合。

13、更为优选的，所述crrna序列如seq id no：16-20的任意序列中所示，进一步优选的，所述crrna序列如seq id no：17中所示。

14、优选的，所述crispr试剂还包括rna报告探针，所述rna报告探针为随机单链rna分子，一端带有一个荧光素基团，一端带有生物素基团。优选的，所述rna报告探针为polyu，更优选的，一端以生物素biotin标记，一端以fam标记。进一步优选的，所述rna报告探针如fam-uuuuuuuuuuuuuu-bio所示。

15、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：1和2所示的rpa扩增引物对和如seq id no：16所示的crrna。

16、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：4和5所示的rpa扩增引物对和如seq id no：17所示的crrna。

17、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：7和8所示的rpa扩增引物对和如seq id no:18所示的crrna。

18、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：10和11所示的rpa扩增引物对和如seq id no:19所示的crrna。

19、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：13和14所示的rpa扩增引物对和如seq id no:20所示的crrna。

20、本发明还提供一种上述任意crispr试剂在制备检测2019-ncov的试剂盒中的用途。

21、本发明还提供一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述任意crispr试剂。

22、本发明还提供一种胶体金检测试剂条，其中，所述胶体金检测试剂条包括：(1)带有抗荧光素的抗体的胶体金颗粒；(2)孵育有抗生物素的抗体的control带；(3)孵育有荧光素二抗的test带。

23、当rpa反应未扩增到目的rna靶序列时，结合有胶体金颗粒的探针与control带结合，test不显色；当rpa反应扩增到目的rna靶序列，crispr试剂会对报告探针进行切割，结合有胶体金颗粒的探针荧光素基团暴露与test带上荧光素二抗结合，从而test带显色，同时control带亦显色。

24、本发明还提供一种利用上述任意crispr试剂检测2019-ncov的方法，所述方法包括：

25、(1)处理样本：将盛放样本的ep管置于干式恒温金属浴，50℃，20分钟，95℃，5分钟；

26、(2)rpa引物对扩增病毒核酸：反应条件：42℃，至少5分钟；

27、(3)利用含对应的crrna的检测液对扩增的核酸进行crispr反应：反应条件37℃，20分钟；

28、(4)加入上样液，进行胶体金检测：读取检测结果。

29、优选的，报告分子的检测通过胶体金检测试纸来实现，完整的报告分子在试纸条上只出现c带，但是游离的报告分子在试纸条上出现c带和t带。胶体金试纸条的检测一般5分钟即可出现明显的检测结果。

30、优选的，所述rpa引物对最低浓度为400nm。

31、优选的，所述rna报告探针最低浓度为300nm。

32、优选的，所述cas13a蛋白最低浓度为50nm。

33、优选的，所述方法不是诊断方法。所述方法可用于各种研究或者流行病学调查等。所述样本并非来源于患者，例如，所述样本可以来源于水、土壤、空气、食物、各种物体表面等。

34、综上，本发明针对2019-ncov的核酸序列设计引物试剂，优化反应体系，通过rpa-crispr联合，在1小时之内得出检测结果。这样我们的试剂盒可以实现无专业技术人员，在任一相对稳定环境，只需要一个恒温装置，一个小时之内即可得出检测结果。

35、通过本引物组，在只有rpa反应情况下，通过产物纯化，琼脂糖凝胶电泳可检出10拷贝的2019-ncov核酸量，大大提高了检测试剂的灵敏度。rpa-cripsr联合进一步提高反应的灵敏度。

36、同时，本发明的crispr试剂对2019-ncov具有高度特异性，不扩增其他冠状病毒，例如sars和mers等。