用于乌蒙凤鸡鉴定的SNP位点组合、引物组合及鉴定方法与流程

本发明涉及家禽品种的鉴定，具体地，涉及一套用于乌蒙凤鸡鉴定的snp位点组合、引物组合及鉴定方法。

背景技术：

1、乌蒙凤鸡，又名“凤头鸡”、“啄(zhuāi)兜鸡”，有200多年历史，是第三次资源普查贵州省新发展的遗传资源。其原产地为贵州省六盘水市，分布在全市范围内的12个乡镇，其中保华镇、牂牁镇为中心产区，临近其他乡镇有零星分布。过去，乌蒙凤鸡因主要产区位于乌蒙山腹地，当地山势险峻，人迹罕至，比较封闭，具备天然的地理隔离条件，较少受到外来禽种干扰。但近年来，由于外来鸡种的大量涌入，乌蒙凤鸡因生产性能相对较低而被大部分农户弃养或乱杂乱配，纯种乌蒙凤鸡只在极端闭锁的少数民族村寨养殖，导致纯种乌蒙凤鸡濒临灭绝。随着我国畜禽遗传资源普查工作的开展，国家对地方鸡资源调查和保护力度更加重视与加强，越来越多的地方鸡新资源受到更多的社会关注，乌蒙凤鸡也逐渐受到社会关注，贵州省也对乌蒙凤鸡资源加大保护力度，并建立了乌蒙凤鸡核心保种场，使得乌蒙凤鸡资源群体逐渐扩大。2018年7月3日，中华人民共和国农业农村部正式批准对“六盘水乌蒙凤鸡”实施农产品地理标志登记保护。为了更好的对乌蒙凤鸡原种的保种与选育，需要收集和保护纯种乌蒙凤鸡，因此乌蒙凤鸡的鉴定必不可少。

2、目前鉴别乌蒙凤鸡主要依靠外观观察，这种观察主观性较强，在鉴定乌蒙凤鸡与其他品种鸡杂种后代时，其外貌相似，鉴定错误率较高。另外，在进行乌蒙凤鸡新资源鉴定时也需要和贵州省已有的地方鸡品种以及外省外观比较相似的品种比如金湖乌凤鸡等品种进行区别，避免“同种异名”现象，实现新资源有效鉴定和保护工作更快的推进。因此，开发一种能有效准确鉴定乌蒙凤鸡资源的方法，应用于乌蒙凤鸡鉴定工作具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对乌蒙凤鸡资源鉴定难的问题，本发明提供了一套用于乌蒙凤鸡鉴定的snp位点组合、引物组合及鉴定方法，所述位点组合包括如下wmf1位点到wmf6位点：

2、 序号 染色体 snp位点id 染色体上的位置 参考基因组 突变位点 wmf1 nc_006113.5 rs317429549 chr26:3883154 g a wmf2 nc_006092.5 rs14511492 chr5:8348023 a g wmf3 nc_006097.5 rs315992594 chr10:19871640 c a wmf4 nc_006099.5 rs316929397 chr12:16243309 g a wmf5 nc_006093.5 rs312886198 chr6:30651981 g a wmf6 nc_006088.5 rs315226425 chr15:10088459 t c

3、各snp位点的引物的核苷酸序列为：

4、

5、所述snp位点的筛选方法为：利用芯片对12个鸡种(乌蒙凤鸡；贵州省7个地方鸡种：乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、矮脚鸡、高脚鸡，与乌蒙凤鸡同为贵州地区的几个鸡种，可能存在杂交情况；其他地区相似的代表性乌骨鸡品种：金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡；国外代表性引进用于杂交配套的品种：哈伯德肉鸡、来航鸡)的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种与其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指top5％，最小等位基因频率>0.2，缺失率<0.1进行筛选，确定220个snp位点，优先选择乌蒙凤鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与乌蒙凤鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于乌蒙凤鸡资源鉴定的6个snp位点。

6、本发明另一方面所要解决的技术问题是提供一种乌蒙凤鸡的鉴定方法，鉴定方法包括如下步骤：

7、(1)提取待测鸡基因组总dna；

8、(2)根据所述的snp位点组合，利用对应的引物组合对分别进行pcr扩增；

9、(3)将pcr扩增产物测序后、判断基因型；

10、(4)如果snp位点组合对应的基因型有一个不符合乌蒙凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于乌蒙凤鸡；如果6个snp位点组合对应的基因型全部符合乌蒙凤鸡的基因型，则判定该个体属于乌蒙凤鸡，6个snp位点wmf1～wmf6的基因型依次为aa、gg、cc、gg、gg、tt。

11、优选地，步骤(1)中所述待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。

12、步骤(2)中，wmf1～wmf6的pcr产物长度分别为221bp、227bp、215bp、240bp、232bp、202bp。各对应产物信息如下：

13、wmf1--221bp(snp位点：192bp处g/a)

14、aataccagtatctagaaagtttccaagcatgtcgaacgagaatcagaatgaatcctctagtgcaaaaatgaattacaggcctctctcactactcagaagcatatcagtattttgcacgcaggcagaaaggaacaaccagaagcagcagaggggagaactgtaggaaggctttgtgaaatgaccttatcccak(g/a)tgaggtgctgttcacctttagaatatgga

15、wmf2--227bp(snp位点：51bp处a/g)

16、aggcaggttgaaagggttttcagacctgacgtttctatcaaagctagacck(a/g)agcccaacttcttcattgatgctatcaacttcagggagttcctttcaaacaagatccatcagacatactgctgtctgcatcaagggaaaaaaacaaacaggctcctttctagccagattaacctgctaccttaaactgccacgtttaaaactacatgcacacacacccagggatat

17、wmf3--215bp(snp位点：32bp处c/a)

18、tgcttcaaggatcccaaaaagcccatctcagk(c/a)taatgcacgttgtttattctcactgctgaaagaaaattagagaaaaaatcaaatcaaatcacagttctggaatgcattgcagagtttatgatccccccttgtattatctctagctctaacccagatttgcagccacgcagtgctcttgttcggtgctctgccaatgcactttgctgtgacctg

19、wmf4--240bp(snp位点：132bp处g/a)

20、tgaaagtgcaaccagtccactgctcctggcagcaacctgcctgggtccttctgctcagatgtgggttctcctcccaactgctgcatcccaggtgatgctcagagcaccttgtgcccatcacatgttcatagk(g/a)gagatggataatgtattttagaaaaccacacttctctgctcttccctaaaagtagggaggtaggagcggagatatctgggagttgtggtggtgacataaagcagctgc

21、wmf5--232bp(snp位点：186bp处g/a)

22、atacgtggtgccagaagaggttttatcttctgtatatatatttttaaaaatttaataaatacaaagcaaatagcattggtttatccaggggaatattgaaatccattaggaatccacttggagtaatctgattcaacaagtcagtatatttctctcaaaaacataatatctgtactacattgtgck(g/a)agatgaaggttagattacatttcttgccagtgcagtaattcccaca

23、wmf6--202bp(snp位点：161bp处t/c)

24、caaccaatggtggctctcttacatgagattagatttgacaaaactatttcccaaagtgtcacagtgcaccatttcttttttctatggagtcattttgaagtctccaaactagtggttaccccagaaagtctaagaggtctgaacgctccattatcacttak(t/c)ttatgaaagtcataatgattaattcttggacgacggagcta

25、通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：

26、采用本发明的snp位点组合进行乌蒙凤鸡资源鉴定，6个snp位点联合基因型判定为乌蒙凤鸡的概率达到99.99％以上。任意一个snp位点基因型排除乌蒙凤鸡的概率即达到100％。因此，只要有一个snp位点基因型不符合乌蒙凤鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于乌蒙凤鸡。