本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及一种锚定在肿瘤细胞膜上、激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。本发明还涉及这种锚定在肿瘤细胞膜上、激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白的溶瘤病毒与慢病毒。本发明还涉及融合蛋白及其溶瘤病毒和慢病毒在肿瘤治疗中的用途。
背景技术：
1、肿瘤已成为危害人类健康最严重的疾病之一。在2021年，全球恶性肿瘤总发病人数达到1974万人，死亡人数约为931万人。随着人口老龄化以及社会环境因素的影响，肿瘤发病人数还将持续增加。预计到2030年发病人数将达到2404万，死亡将达到1294万人。为了提高生存率，既要做好癌症的预防和筛查，同时也要不断开发出有效且价格便宜的治疗癌症的新药。
2、机体的免疫系统本身就有强大的抗肿瘤功能，包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、inkt细胞、粘膜相关不变t(mucosal associated invariant t，mait)细胞、γδt细胞、k细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。其中，t细胞在免疫系统中发挥着重要的作用，它们具有识别和消灭异常细胞例如肿瘤细胞的能力。肿瘤是由异常生长和分裂的细胞组成，而t细胞则可以通过多种方式来对抗肿瘤。
3、一种方式是通过细胞毒性t细胞(ctls)，它们能够识别并杀死肿瘤细胞。ctls识别肿瘤细胞表面上的抗原，这些抗原是与肿瘤细胞异常表达的蛋白质有关的，然后释放细胞毒素来杀死肿瘤细胞。此外，ctls还可以分泌细胞因子，如干扰素和肿瘤坏死因子，来进一步抑制肿瘤生长。
4、另一种方式是通过辅助性t细胞(th细胞)，它们可以调节免疫应答。th细胞可以分化为不同的亚型，比如th1和th2。th1细胞产生干扰素等细胞因子，可以激活ctls和巨噬细胞，从而加强对肿瘤细胞的攻击。th2细胞则可以产生某些细胞因子，帮助b细胞产生抗体，提供肿瘤抗原的特异性识别。
5、nk细胞在固有免疫应答和适应性免疫应答中都发挥关键作用，具有多种细胞毒作用机制，并且能够通过产生细胞因子调节免疫反应。nk细胞全名为“自然杀伤细胞”(natural killer cells)，是免疫系统中的一类特殊细胞。与其它免疫细胞不同，nk细胞可以选择性地溶解细胞，而无需提前活化，其天生就具有进行杀伤肿瘤细胞的作用。
6、如何充分发挥或者调动机体免疫系统中的抗肿瘤细胞发挥抗肿瘤功能，是一个非常重要的抗肿瘤新药开发方向。
7、cd3是一个经典的信号靶点。目前在对于双抗的研究中超过一半的抗体都是通过cd3来激活t细胞。cd3是t细胞膜上的重要生物标志物，包括四条蛋白链，即cd3δ、cd3ε、cd3γ和cd3ζ。其中，两对异源二聚体，即cd3δ/cd3ε和cd3γ/cd3ε，可以与t细胞受体共同形成tcr/cd3复合物，参与t细胞抗原识别、信号转导和t细胞发育的调节。tcr的细胞内域域非常短，不能独立完成信号转导，如嵌合抗原受体car-t细胞疗法的形式。与car-t相比，双特异性抗体可以进行剂量控制以降低毒性。因此，cd3在双特异性抗体领域是一个很有前途的肿瘤治疗靶点。
8、但是，双特异性抗体在聚焦肿瘤靶向性与特异型性的同时会损失其广谱性。一种cd3双特异性抗体往往只针对一个靶点，疾病适应症往往比较单一，这增加了产品开发的成本，并且延长了产品上市的周期。
9、因此，针对上述这些缺陷，有必要针对cd3分子充分开发一种更加广谱、更加安全有效的t细胞活化策略，从而升抗肿瘤活性。
10、溶瘤病毒是具有感染肿瘤细胞并且可裂解破坏肿瘤的一类病毒。通常使用的溶瘤病毒是借助其肿瘤细胞感染特异性，在不会非特异杀伤破坏正常细胞的情况下，选择性地感染肿瘤组织，或在肿瘤细胞内大量复制，或释放细胞毒性因子，最终让肿瘤细胞裂解，溶瘤后释放的子代病毒继续感染邻近的肿瘤细胞。或者，溶瘤病毒携带的目的基因表达相应的蛋白增强机体的抗肿瘤反应，在肿瘤细胞死亡后，肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原，诱导全身抗肿瘤免疫反应，致使未暴露于病毒的远处肿瘤消退。目前，溶瘤病毒药物已经在多个实体瘤领域开展临床试验，包括黑色素瘤、头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤。
11、病毒因其天然的细胞裂解功能，是杀伤肿瘤细胞的有效选择。从最初的天然病毒到经过基因编辑的病毒，溶瘤病毒的种类也从最初的疱疹病毒发展到十多种常用的病毒。其中腺病毒以其基因编辑的简易性和使用的灵活性成为了最为常用的溶瘤病毒。其它常用的病毒包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等。溶瘤病毒的种类涵盖了从单链病毒到双链病毒，从rna病毒到dna病毒以及从天然病毒到基因编辑病毒，从而极大地提升了该疗法的在实体瘤临床治疗中的灵活性。
12、基因修饰的溶瘤病毒可以克服天然溶瘤病毒受体亲和力弱、感染效率低以及非特异性感染等问题，能够更有效、更安全地靶向感染肿瘤细胞。
13、但是，目前溶瘤病毒作为治疗性药物仍然面临众多挑战。其中一个是其单药总体疗效有限，据现有数据显示溶瘤病毒的总体疗效＜30％。另一个是基于其抗肿瘤机制以及本身特性，给药途径局限于瘤内注射。但是，对于转移性癌症的治疗仍然需要采取全身血液递送。溶瘤病毒的给药途径局限于瘤内注射的主要原因是：人体内广泛存在病毒膜受体，使得病毒感染的肿瘤特异性较低，极大可能对正常细胞组织进行感染破坏；溶瘤病毒进入血液之后会和血清中的病毒特异性抗体中和，继而被移除；血液会对病毒产生稀释作用，并且肿瘤微环境会抑制病毒对肿瘤组织有效浸润。
14、因此，目前还需要开发更加有效且便于给药的溶瘤病毒。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的发明目的是提供一种激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白及其重组病毒和用途。一方面，本发明针对免疫细胞表面抗原开发了更加广谱和安全有效的免疫细胞活化策略，从而提升了抗肿瘤活性。例如，本发明针对t细胞表面的cd3分子开发了将cd3激活性抗体锚定在肿瘤细胞膜上的融合蛋白，通过激活cd3分子活化t细胞。另一方面，本发明还针对融合蛋白开发了腺病毒载体，痘苗病毒载体和慢病毒载体等重组病毒载体，借助重组病毒载体使融合蛋白靶向到肿瘤组织细胞，以拓宽融合蛋白的给药途径。
2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本发明的第一方面提供了一种激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白，其包含胞外域、铰链区、跨膜域和胞内域；其中，所述胞外域是特异性结合免疫细胞表面抗原的多肽或其活性片段，通过与所述免疫细胞表面抗原特异性结合来激活免疫细胞的杀伤功能；所述跨膜域是将所述融合蛋白锚定在肿瘤细胞的细胞膜上的多肽；所述铰链区连接所述胞外域和所述跨膜域。
4、根据本发明所述的融合蛋白，其中，所述免疫细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞、inkt细胞、粘膜相关不变t细胞、γδt细胞、k细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的一种或多种；所述免疫细胞表面抗原选自cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd25、cd27、cd28、cd45、cd49、cd56、cd62l、cd94、cd122、cd16、cd32、cd64、cd68、cd80、cd86、cd127、cd137、cd152、cd197、cd369、α4-1bb、nkp46和sirpα的一种或多种。
5、优选地，所述免疫细胞选自t细胞、nk细胞和巨噬细胞中的一种或多种；所述免疫细胞表面抗原选自cd3、cd28、α4-1bb、nkp46、cd16和sirpα的一种或多种。
6、根据本发明所述的融合蛋白，其中，所述胞外域包含选自如下的一种或多种：
7、如seq id no：8所示的氨基酸序列或其活性片段；
8、如seq id no：32所示的氨基酸序列或其活性片段；
9、如seq id no：34所示的氨基酸序列或其活性片段
10、如seq id no：36所示的氨基酸序列或其活性片段；
11、如seq id no：38所示的氨基酸序列或其活性片段；
12、如seq id no：40所示的氨基酸序列或其活性片段；和
13、如seq id no：42所示的氨基酸序列或其活性片段。
14、根据本发明所述的融合蛋白，其中，所述铰链区选自如下的一种或多种：
15、(1)抗体igg4的铰链区或其突变体；
16、(2)抗体igg4的铰链区或其突变体、和ch2区；
17、(3)抗体igg4的铰链区或其突变体、ch2区和ch3区；
18、(4)抗体igg1的铰链区或其突变体；
19、(5)抗体igg1的铰链区或其突变体、和ch2区；
20、(6)抗体igg1的铰链区或其突变体、ch2区和ch3区；
21、(7)免疫球蛋白fc受体的铰链区：fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)、fcαr(cd89)、fcεri或fcεrii(cd23)；
22、(8)共刺激分子cd28铰链区、cd137铰链区、cd8铰链区、cd4铰链区、pd-1铰链区或ctla-4铰链区；和
23、(9)以上任何的不同铰链区组合。
24、优选地，所述铰链区是cd8铰链区。
25、更优选地，所述铰链区包含如seq id no：10所示的氨基酸序列或其活性片段。
26、根据本发明所述的融合蛋白，其中，所述跨膜域选自如下的一种或多种：t细胞受体复合物的cd3ξ链的跨膜域、cd28跨膜域、免疫球蛋白fc受体跨膜域、cd4跨膜域、cd8跨膜域、cd16跨膜域、cd137跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、vista跨膜域及其组合。
27、优选地，所述跨膜域是cd8跨膜域。
28、更优选地，所述跨膜域包含如seq id no：12所示的氨基酸序列或其活性片段。
29、根据本发明所述的融合蛋白，其中，所述胞内域是所述融合蛋白存在于肿瘤细胞内的特定区域。具体地，所述胞内域是参与细胞信号传导、负责磷酸化特定的底物蛋白的激酶结构域，或者是与dna结合、调控基因表达的dna结合结构域，或者是参与细胞信号传导、负责gtp水解反应的gtp酶结构域，或者是调节基因的转录过程的转录因子结构域，或者是不发挥任何生物学功能、只起到锚定膜蛋白的作用的某段亲水序列。在实际应用中，本领域技术人员根据需要能够选择合适的胞内域。
30、根据本发明所述的融合蛋白，其胞外域可以包括激活同一免疫细胞的不同多肽(即，同一免疫细胞上互为协同信号通路激活的结构域组合)，也可以包括激活不同免疫细胞的多肽。
31、在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的胞外域是特异性结合t细胞表面抗原cd3、4-1bb或cd28的多肽，氨基酸序列分别如seq id no：8、seq id no：32或seq id no：34所示。或者，所述融合蛋白的胞外域包括特异性结合t细胞表面抗原cd3的多肽和特异性结合t细胞表面抗原4-1bb或cd28的多肽。
32、在一个更优选的实施方案中，所述融合蛋白的胞外域是特异性结合t细胞表面抗原cd3的多肽，铰链区是cd8铰链区，跨膜域是cd8跨膜域。该融合蛋白的氨基酸序列如seqid no：29所示。
33、在另一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的胞外域是特异性结合nk细胞表面抗原nkp46或cd16的多肽，氨基酸序列分别如seq id no：38或seq id no：36所示。
34、在另一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的胞外域是特异性结合巨噬细胞表面抗原sirpα的多肽，氨基酸序列如seq id no：40所示。
35、本发明的融合蛋白可以单独使用，还可以与其它免疫功能分子组合应用。因此，本发明的第二方面提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和免疫功能分子，其中所述免疫功能分子选自细胞因子、趋化因子和免疫检查点阻断抗体的一种或多种。
36、优选地，所述细胞因子选自gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、il-23、il-24、il-33、il-35、il-37、ifn-α、ifn-β、ifn-γ和malp-2的一种或多种；更优选地，所述细胞因子是il-21，其氨基酸序列如seq id no：19所示。
37、优选地，所述趋化因子选自cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、ccl4、ccl19、ccl20、ccl21和cx3cl1的一种或多种；更优选地，所述趋化因子是cxcl13，氨基酸序列如seqid no：23所示。
38、优选地，所述免疫检查点阻断抗体选自ctla-4阻断抗体、cd47阻断抗体、sirpα阻断抗体、pd-1阻断抗体、pd-l1阻断抗体、lag-3阻断抗体和tim-3阻断抗体的一种或多种。
39、在一个更优选的实施方案中，本发明的融合蛋白响应于缺氧环境，因此相应地，根据本发明的药物组合物还包含在常氧条件下降解而在缺氧条件下稳定的氧敏感序列；优选地，所述氧敏感序列包含如seq id no：15所示的氨基酸序列或其活性片段。
40、在此应当说明的是，在根据本发明的药物组合物中，所述融合蛋白、所述免疫功能分子和所述氧敏感序列分别作为单独的组分被包含在所述药物组合物中；或者，所述融合蛋白、所述免疫功能分子和所述氧敏感序列中的任意两种或更多种通过接头连接在一起。所述接头可以是本领域中常用的任意接头，例如t2a剪切肽、p2a剪切肽或者ires序列，其中，t2a剪切肽的氨基酸序列分别如seq id no：21所示，p2a剪切肽氨基酸序列分别如seqid no：17所示。
41、本发明的第三方面提供了一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。具体地，所述多核苷酸包含编码胞外域、铰链区、跨膜域和胞内域的核苷酸序列。
42、在一个具体的实施方案中，特异性结合cd3、α4-1bb、cd28、cd16、nkp46或sirpα的胞外域的编码序列分别如seq id no：7、31、33、35、37或39所示。
43、在另一个具体的实施方案中，铰链区的编码序列如seq id no：9所示。
44、在另一个具体的实施方案中，跨膜域的编码序列如seq id no：11所示。
45、在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸是如seq id no：28所示的核苷酸序列。
46、本发明的融合蛋白可以采用不同的递送载体递送至肿瘤细胞，递送载体包括但不限于：重组病毒载体、mrna/dna、蛋白分子载体、脂质纳米粒、外囊泡(evs)等。因此，本发明的第四方面提供了一种重组病毒载体，其包含本发明的多核苷酸。本发明的重组病毒载体可以通过将所述多核苷酸插入到病毒载体中而制备得到。
47、优选地，所述重组病毒载体的病毒骨架来源于重组腺病毒、重组痘苗病毒、重组单纯疱疹病毒、腺相关病毒、水痘-带状疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、生里基森林病毒、eb病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、痘苗病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、慢病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人t细胞白血病病毒1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病毒；更优选地，所述重组病毒载体的病毒骨架是细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒。
48、为了能够将本发明的融合蛋白和免疫功能分子同时递送至肿瘤细胞，本发明的重组病毒载体还包含表达免疫功能分子的多核苷酸；其中，所述免疫功能分子选自细胞因子、趋化因子和免疫检查点阻断抗体的一种或多种。
49、优选地，所述细胞因子选自gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、il-23、il-24、il-33、il-35、il-37、ifn-α、ifn-β、ifn-γ和malp-2的一种或多种。更优选地，所述细胞因子是il-21，编码其的多核苷酸如seq id no：18所示。
50、优选地，所述趋化因子选自cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、ccl4、ccl19、ccl20、ccl21和cx3cl1的一种或多种。更优选地，所述趋化因子是cxcl1 3，编码其的多核苷酸如seq id no：22所示。
51、优选地，所述免疫检查点阻断抗体选自ctla-4阻断抗体、cd47阻断抗体、sirpα阻断抗体、pd-1阻断抗体、pd-l1阻断抗体、lag-3阻断抗体和tim-3阻断抗体的一种或多种。
52、在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种重组腺病毒载体。该重组腺病毒载体源自黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1，并且，所述黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1的启动子被构建为肿瘤特异性启动子和缺氧响应性启动子，和/或在所述黑猩猩腺病毒adc68xy-r1的e1a基因下游插入缺氧调控元件的表达框架。
53、优选地，所述肿瘤特异性启动子是人端粒酶逆转录酶(htert)启动子，其序列如seq id no：1所示。
54、优选地，所述肿瘤特异性启动子还可以选自癌胚抗原(cea)启动子、甲胎蛋白(afp)启动子，人前列腺特异性抗原(psa)启动子，环氧化酶-2(cox-2)启动子、凋亡抑制蛋白(survivin)启动子或人肠组织特异抗原(a33)启动子等。
55、优选地，所述缺氧响应性启动子是响应于缺氧触发的转录控制系统的启动子，其包含编码氧敏感序列的多核苷酸，例如，其包含缺氧调控元件hre。例如，所述缺氧响应性启动子的序列如seq id no：2所示，其为5个hre的串联元件(5hre)；或者，所述缺氧响应性启动子的序列如seq id no：3所示，其为4个hre的串联元件(4hre)。
56、作为一个优选的示例，所述重组腺病毒载体上插入了表达特异性结合cd3的融合蛋白、il-21和cxcl13的核苷酸序列。这些插入的核苷酸序列(也可称为插入元件)由4hre、5hre与截短的cmv启动子cmd3或minip进行组合调控。其中cmd3启动子的序列如seq id no：4所示，minip启动子的序列如seq id no：5所示。
57、优选地，所述重组腺病毒载体上还插入了调控转录起始或终止的元件的编码核酸，例如5’utr、3’utr和bgh poly a等。其中，5’utr的序列如seq id no：6所示，3’utr的序列如seq id no：24所示，bgh poly a的序列如seq id no：25所示。
58、优选地，所述重组腺病毒载体上还插入了表达氧敏感序列的核苷酸序列，其可以是如seq id no：14所示的核苷酸序列。
59、优选地，所述重组腺病毒载体上插入的各序列之间可以通过接头序列连接，例如t2a剪切肽、p2a剪切肽或者ires序列，其中，t2a剪切肽的编码核酸如seq id no：20所示，p2a剪切肽的编码核酸如seq id no：16所示。此外，各序列之间的接头序列还可以是如seqid no：13所示的核苷酸序列。
60、本领域技术人员可以理解的是，上述的趋化因子、细胞因子以及本发明的融合蛋白等的目的基因受hre为核心的缺氧响应启动子的调控：在常氧下该启动子活性极低，无法有效启动目的基因的转录翻译；而在缺氧条件下，缺氧诱导因子-1(hypoxia induciblefactor-1，hif-1)复合物入核并结合hre元件，有效激活启动子活性，促进目的基因的高效表达。
61、与此同时，融合蛋白偶联的氧敏感序列在常氧下降解而缺氧条件下稳定的特性可进一步增强目的基因的缺氧表达的特异性。
62、作为一个特别优选的示例，本发明的重组腺病毒载体包含如seq id no：26或seqid no：27所示的核苷酸序列。
63、本发明的重组腺病毒载体可以以黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1的基因组为基础框架制备得到。具体地，本发明的重组腺病毒载体可以通过包括如下步骤的方法制备：
64、以黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1的基因组为基础框架，将本发明所述的多核苷酸，和可选地所述表达免疫功能分子的多核苷酸，克隆至复制型黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1；和/或
65、将黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1的启动子替换为所述肿瘤特异性启动子和所述缺氧响应性启动子；和/或在所述黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1的e1a基因下游插入缺氧调控元件的表达框架。
66、在本发明中，黑猩猩腺病毒载体adc68xy-r1可以通过市场购买获得，例如，可以购买自苏州相奕生物技术有限公司。
67、作为一个示例，本发明的重组腺病毒载体可以通过包括如下步骤的方法制备：
68、(1)人工合成缺氧响应的外源基因序列
69、5hre-cmd3-cd3tm-odd22-p2a-il21-t2a-cxcl13或
70、4hre-minip-cd3tm-odd22-p2a-il21-t2a-cxcl13；
71、(2)将所述外源基因序列克隆至adc68xy-r1载体中，得到重组质粒padc68xy-r1-5hre-cmd3-cd3tm-odd22-p2a-il21-t2a-cxcl13或padc68xy-r1-4hre-minip-cd3tm-odd22-p2a-il21-t2a-cxcl13；
72、(3)将所述重组质粒转染hek293细胞，进行包装得到重组腺病毒；
73、(4)对所述重组腺病毒的噬斑进行纯化及鉴定；和
74、(5)验证所述重组腺病毒的功能。
75、在此应当说明的是，在本发明中，“重组腺病毒”与“重组溶瘤腺病毒”具有相同的含义，二者可互换使用。
76、在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种重组痘苗病毒载体。优选地，所述重组痘苗病毒载体源自痘苗病毒天坛株载体，例如痘苗病毒天坛株载体752-1(购买自上海鑫湾生物科技有限公司)。更优选地，所述重组痘苗病毒载体是在痘苗病毒天坛株载体的c9区插入了如seq id no：30所示的核苷酸序列。
77、本发明的重组痘苗病毒载体可以通过包括如下步骤的方法制备：
78、将如seq id no：30所示的核苷酸序列亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒psc65的c9区中，构建重组质粒；和
79、采用基因同源重组的方式将所述重组质粒转染到已经被野生型痘苗病毒感染的人胸腺激酶缺陷型细胞中，使二者同源重组，得到所述重组痘苗病毒载体。
80、作为一个示例，本发明的重组痘苗病毒载体可以通过包括如下步骤的方法制备：
81、(1)合成如seq id no：30所示的外源基因序列6*loxp-p11-αcd3-tm；
82、(2)将外源基因序列6*loxp-p11-αcd3-tm亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒psc65的c9区中，构建出重组质粒psc65-c9-6*loxp-p11-αcd3-tm；
83、(3)采用基因同源重组的方式，将psc65-c9-6*loxp-p11-αcd3-tm重组质粒转染到已经被感染了野生型痘苗病毒的人胸腺激酶缺陷型细胞(tk143-细胞)中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rtv-psc65-c9-6*loxp-p11-αcd3-tm；和
84、(4)进行筛选，获得c9区包含seq id no.30所示的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒。
85、在此应当说明的是，在本发明中，“重组痘苗病毒”与“重组溶瘤痘苗病毒”具有相同的含义，二者可互换使用。
86、在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种重组慢病毒载体。其中，慢病毒载体是在人免疫缺陷病毒(hiv-1病毒)基础上改造而成的病毒载体系统。
87、在本发明中，慢病毒载体可以通过市场购买获得。例如，慢病毒载体可以由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
88、优选地，所述重组慢病毒载体包含如seq id no：28所示的核苷酸序列。
89、本发明的重组慢病毒载体可以通过将如seq id no：28所示的核苷酸序列克隆至空白慢病毒表达质粒pxw-ef1α-mcs而制备得到。
90、作为一个示例，本发明的重组慢病毒载体可以通过包括如下步骤的方法制备：
91、(1)合成如seq id no.28所示的外源基因序列αcd3-cd8 tm；
92、(2)将外源基因序列αcd3-cd8 tm克隆至慢病毒表达载体中，获得αcd3-cd8 tm慢病毒表达质粒；和
93、(3)将慢病毒表达质粒、骨架质粒和包膜质粒共转染至hek293t细胞，包装并获得慢病毒颗粒，经过离心浓缩获得慢病毒浓缩液，即为重组慢病毒载体。
94、本发明的第五方面提供了一种重组病毒，其可以将上述的融合蛋白或上述的药物组合物递送至肿瘤细胞。所述重组病毒可以由本发明的重组病毒载体包装获得。
95、在此应当说明的是，在某些情形下，可以不对本发明的重组病毒载体和重组病毒进行严格区分。
96、本发明的第六方面提供了一种药物组合物，其包含本发明的重组病毒载体或重组病毒。
97、本发明的重组病毒载体或重组病毒可以单独使用，也可以与免疫细胞联合使用。因此，本发明的药物组合物还包含免疫细胞。
98、优选地，所述免疫细胞选自t细胞、car-t细胞、inkt细胞、nk细胞、k细胞、巨噬细胞、car-inkt细胞、car-nk细胞和car-巨噬细胞的一种或多种。
99、更优选地，所述t细胞选自未经分选纯化的t细胞、分选纯化的t细胞、分选纯化的pd-1+t细胞、分选纯化的cd137+t细胞、分选纯化的cd1 60+t细胞、分选纯化的纯真t细胞(tnaive)、分选纯化的中央记忆型t细胞(tcm)、分选纯化的效应记忆型t细胞(tem)、分选纯化的效应t细胞(tem ra)、分选纯化的过渡记忆型t细胞(transitional memory t cells，ttm)和分选纯化的组织记忆型t细胞(tissue residential memory t cells，trm)的一种或多种。
100、本发明的第七方面提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白、多核苷酸、重组病毒载体、重组病毒或药物组合物。
101、本发明的第八方面提供了本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的重组病毒载体、本发明的重组病毒或本发明的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
102、优选地，所述肿瘤选自b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤、高级别胶质瘤、母细胞瘤神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、aids相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病的一种或多种。
103、本发明的有益效果是：
104、本发明提供的锚定在肿瘤细胞膜上、能够激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白的溶瘤病毒克服了实体瘤肿瘤细胞对人类免疫细胞(例如t细胞)的肿瘤免疫抑制和免疫逃避的限制。其能够直接将人体免疫细胞(例如t细胞)募集到实体瘤内部，从而对肿瘤细胞进行肿瘤细胞杀伤。本发明提供的能够激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞的融合蛋白的溶瘤病毒还克服了抗肿瘤药物中对靶点的限制，具有多种肿瘤的广谱杀伤活性，具有广阔的应用前景。
105、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅限制，在此不再一一赘述。