一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法。

背景技术：

1、蛇油的主要化学成分为多种脂肪酸。一方面能够促进皮肤新陈代谢、增强细胞活力、抗氧化和抗皮肤衰老、增加光泽等功效，并且对于皮肤黏膜系统具有较强的亲和力以及良好的渗透性，因而常被用于制备美容护肤方面的高级化妆品；另一方面，具有降低烫伤部位血管渗透性，抗炎止痛，降血脂，降血糖及抑菌等作用，常与其他药物结合制备复方外用制剂用于治疗各种皮肤病。

2、蛇资源作为药材在我国中医药与民间医药中具有悠久的历史，并且在2020年颁布野生动物禁食令后，蛇类资源的利用仅限于药用和观赏，但目前市面上制备蛇油的方法常为直接从蛇身上提取脂肪组织，并采用酸水解法或加热方法从蛇脂中提炼蛇油。该方法虽能直接提取所需药材，提取方法复杂，效率低且耗费成本高。

3、此外，由于蛇油提取过程面临着动物伦理、卫生、传染病等一系列问题，对于蛇油治疗研究能力和治疗水平难以提升。而如今利用细胞培养的方式来产生各种动物组织的研究诸多，例如细胞培养肉，技术已经较为成熟。因此，建立一种利用细胞培养提炼蛇油替代直接提取的技术迫在眉睫，并且有望为科研事业提供一个新的方向以及做出新的贡献。

4、目前还未有文献报道蛇细胞的培养及蛇细胞的利用，如何培养蛇细胞，以及是否可以通过培养蛇脂肪细胞生产蛇油亟待进一步探究。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法，所述方法不仅提供了一种可行的大规模培养蛇脂肪细胞的方法，而且通过蛇脂肪细胞的培养成功获得蛇油。

2、本发明的第一方面提供了一种获得蛇的永生化脂肪前体细胞的方法，包括如下步骤：

3、s1：消化处理蛇活体的脂肪样本，获得单细胞混合物；

4、s2：培养单细胞混合物，通过差速贴壁培养，纯化得到脂肪前体细胞；

5、s3：对脂肪前体细胞进行连续传代培养，得到永生化脂肪前体细胞。

6、在一些实施方案中，所述步骤s1消化处理之前，还包括：从蛇活体取得少量脂肪样本，进行消毒和/或清洗。

7、在一些实施方案中，所述消毒使用的消毒液为乙醇溶液，例如75%的乙醇溶液，清洗使用的清洗液为含有抗生素的生理盐水；消毒和清洗的时间各为3~5分钟。对脂肪样本进行消毒有利于去除细菌和病毒，避免样本因受到感染而失去增殖和分化的能力，甚至死亡；对样本进行清洗有利于除去杂质，比如血液和粘膜等非脂肪组织等。

8、在一些实施方案中，所述步骤s1中，消化处理采用消化酶，所述消化酶包括分散酶和胰酶替代物，所述分散酶为i型胶原蛋白酶和中性蛋白酶ii的混合酶。

9、在一些实施方案中，所述步骤s1中，消化酶中i型胶原蛋白酶的终浓度为0.1%~0.5%（w/v）、中性蛋白酶ii的终浓度为0.2~0.5% （w/v）、胰酶替代物的终浓度为1%~5%（w/v）。高于此浓度时，对干细胞的活性损伤较大，不利于保持脂肪前体细胞的完整性；低于此浓度时，不利于组织的消化。

10、在一些实施方案中，所述步骤s1中，消化时间为0.5~2小时，消化温度为30~40℃。

11、在一些实施方案中，所述步骤s2中，培养单细胞混合物的培养基包含：低糖培养基、fbs、谷氨酰胺和重组表皮生长因子。在早期细胞培养阶段使用低糖培养基，有助于限制脂肪细胞的过早分化和保持细胞品质的稳定，重组表皮生长因子有助于帮助细胞系的快速建立。

12、在一些实施方案中，所述步骤s2中，所述低糖培养基选自含有1g/l葡萄糖的基础培养基dmem。

13、在一些实施方案中，所述培养单细胞混合物的培养基包含：75~85% （v/v）dmem、15~20%（v/v) 胎牛血清fbs、0.5~2% （v/v）的100×谷氨酰胺和0.01~0.02% （w/v）的人重组表皮生长因子。添加谷氨酰胺和人重组表皮生长因子后，该培养基中蛇的脂肪前体细胞的自我更新和潜在分化能力得到增强。

14、在一些实施方案中，所述步骤s2中，培养单细胞混合物的培养温度为31~34℃，所述贴壁培养的时间为1-6小时。低于37℃的培养温度（例如31~34℃）更接近蛇类在非冬眠条件下的自然体温，更适合蛇的细胞的生长和分化；选择贴壁培养时间为1~6小时可以快捷且较好地排除贴壁慢的分化状态下的脂肪细胞和其它非脂肪细胞。

15、在一些实施方案中，所述步骤s3中，所述永生化脂肪前体细胞为通过传代培养自发生成，还可以加0.5~2% cee (chicken embryo extract /鸡胚提取物)诱导提高永生化效率，例如传代25代以上。避免了使用传统的病毒等载体导入sv40和tert等方法可能相关的高成本和对最终产品品质的影响的风险。

16、在一些实施方案中，所述步骤s3中，连续传代培养的培养基包含：75~85%（v/v）dmem、15~20%（v/v）胎牛血清fbs、0.5~2%（v/v）的100×谷氨酰胺、0.01~0.02% （w/w）的人重组表皮生长因子，和0.5~2%（v/v）cee 。

17、本发明的第二方面提供了一种获得大量蛇的脂肪细胞的方法，包括如下步骤：

18、s1：消化处理蛇活体的脂肪样本，获得单细胞混合物；

19、s2：培养单细胞混合物，通过差速贴壁培养，纯化得到脂肪前体细胞；

20、s3：对脂肪前体细胞进行连续传代培养，得到永生化脂肪前体细胞；

21、s4：对永生化脂肪前体细胞进行成脂分化培养，得到大量成熟的脂肪细胞。

22、所述s1-s3与本发明第一方面的任一实施方案中的步骤s1-s3相同。

23、在一些实施方案中，所述步骤s4中，成脂分化培养的培养基含有葡萄糖、nmn(β-烟酰胺单核苷酸)、 y-27632 (rhoa/rock抑制剂）、胰岛素和磷脂酰胆碱等添加剂。葡萄糖、nmn、 y-27632、胰岛素和磷脂酰胆碱的添加有助于促进脂肪前体细胞向含有大量脂质成分的成熟脂肪细胞的分化的进程， 其中y-27632还有助于预防细胞的衰老和成纤维化分化。

24、在一些实施方案中，所述步骤s4中，成脂分化培养的培养基包含：75~85%（v/v）dmem培养基、 15~20%（v/v）胎牛血清、0.5~2%(v/v)100x谷氨酰胺、35~60mg/ml葡萄糖、200~400mg/l nmn、5~10μm y-27632、1.5~3μg/ml胰岛素和1.5~3mg/ml磷脂酰胆碱。

25、在一些实施方案中，所述步骤s4成脂分化培养前，还包括对永生化脂肪前体细胞进行大规模培养的步骤。

26、在一些实施方案中，所述大规模培养的培养基包含高糖培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、重组表皮生长因子、葡萄糖、nmn和 y-27632 (rhoa/rock抑制剂）培养基。胎牛血清、高糖（葡萄糖）和nmn有助于提供脂肪前体细胞的快速生长增殖所需的能量和nad+；y-27632有助于预防细胞的衰老和成纤维化分化。

27、在一些实施方案中，所述高糖培养基选自含有4.5g/l葡萄糖的基础培养基dmem。

28、在一些实施方案中，所述大规模培养的培养基包含：75~85%（v/v）dmem培养基，15~20%（v/v）胎牛血清、 0.5~2%(v/v)谷氨酰胺、0.01~0.02% （w/w）重组表皮生长因子、35~60mg/ml葡萄糖、200~400mg/l nmn和 5~10μm y-27632 (rhoa/rock抑制剂）。

29、本发明的第三方面提供了一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法，包括以下步骤：

30、s1：消化处理蛇活体的脂肪样本，获得单细胞混合物；

31、s2：培养单细胞混合物，通过差速贴壁培养，纯化得到脂肪前体细胞；

32、s3：对脂肪前体细胞进行连续传代培养，得到永生化脂肪前体细胞；

33、s4：对永生化脂肪前体细胞进行成脂分化培养，得到大量成熟的脂肪细胞；

34、s5：离心收集成熟的脂肪细胞，从收集的脂肪细胞中得到蛇油成分。

35、所述s1-s4与本发明第二方面的任一实施方案中的步骤s1-s4相同。

36、在一些实施方案中，所述步骤s5中，成熟的脂肪细胞通过低速离心进行收集；低速离心方法可快速收集细胞并避免成熟脂肪细胞膜的破裂。

37、在一些实施方案中，所述步骤s5中，收集的成熟脂肪细胞再通过低温超速离心得到蛇油成分。通过超速离心实现细胞的破裂以及油脂成分和水相的分离，也可避免传统高温加热蛇脂的方式对脂肪细胞某些活性成分造成的破坏，可有效保护蛇油中的所有活性成分。

38、本发明的第四方面提供了一种蛇的脂肪前体细胞连续传代培养的培养基：75~85（v/v）% dmem、15~20%（v/v）胎牛血清fbs、0.5~2% （w/w）的100×谷氨酰胺和0.01~0.02%（w/w）的人重组表皮生长因子，和0.5~2% （v/v）cee 。

39、本发明的第五方面提供了一种蛇的永生化脂肪前体细胞成脂分化的培养基：75~85%（v/v）dmem培养基、 15~20%（v/v）胎牛血清fbs、0.5~2%(v/v)100×谷氨酰胺、35~60mg/ml葡萄糖、200~400mg/l nmn，5~10μm y-27632 (rhoa/rock抑制剂）， 1.5~3μg/ml胰岛素和1.5~3mg/ml磷脂酰胆碱。

40、本发明的第六方面提供了一种蛇的永生化脂肪前体细胞大规模培养的培养基：75~85%（v/v）dmem培养基，15~20%（v/v）胎牛血清fbs、0.5~2%(v/v)100×谷氨酰胺、0.01~0.02%（w/w）重组表皮生长因子、35~60mg/ml葡萄糖、 200~400mg/l nmn和 5~10μm y-27632(rhoa/rock抑制剂）。

41、与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

42、（1）本发明首次提供了一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法，包括获得蛇的永生化脂肪前体细胞、成脂分化培养得到大量成熟的脂肪细胞、从成熟的脂肪细胞获得蛇油，提供了完整的解决方案。

43、（2）本发明仅需要取得少量的蛇脂肪组织，通过传代培养，即可获得高纯度、高活性、具有较强的增殖和自我更新能力的脂肪前体细胞，可传代培养40代以上，经分化可以得到大量的成熟脂肪细胞。

44、（3）本发明提供了在细胞培养的各个阶段的培养基，安全性高、稳定性好；前期和中期培养的细胞培养基有利于脂肪前体细胞保持在高速生长的未分化的状态，而后期的分化培养基可有效促进脂肪细胞的分化成熟。

45、（4）本发明获得的蛇油来自蛇的脂肪细胞，其成分和从蛇体脂肪细胞获得的成分一致，可获得大量蛇体脂肪细胞和蛇油成分，便于工业化生产，可以部分替代传统技术生产的蛇油，以及应用于生产护肤品和医疗科研等领域。