一种用于检测JAK2V617F突变的引物和探针组合及试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测。更具体地，涉及一种用于检测jak2 v617f突变的引物和探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，mpn)是由分化相对成熟的一系或多系骨髓细胞不断克隆性增殖所致的一类造血系统肿瘤性疾病，主要包括真性红细胞增多症(polycythemia vera，pv)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，et)、原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，pmf)。据研究，jak2 v617f突变常见于67～97％的pv患者、30～50％的et患者和35～67％的pmf患者，与mpn发病密切相关。世界卫生组织(who)于2008年将jak2 v617f突变纳入了pv、pt和pmf的诊断标准，于2016年将jak2v617f突变检测作为诊断mpn的主要标准。

2、jak2 v617f突变是指janus激酶2(janus kinase 2，jak2)的假激酶(jh2)结构域中第617位密码子的氨基酸残基由缬氨酸(v)突变为苯丙氨酸(f)。此突变会导致催化“非活化状态激酶”的jh2结构域对jak2起到负调控作用，自动激活jak2的激酶结构域，使细胞因子信号转导通路过度活化，含有jak2v617f突变的细胞对造血细胞因子的刺激敏感性增加，导致红细胞、白细胞、血小板等血细胞异常增殖，造成骨髓增殖性肿瘤的发生。随着对mpn认识的不断深入及靶向治疗的开展，jak激酶抑制剂芦可替尼(ruxolitinib)已经被fda批准用于治疗高风险骨髓纤维化和真性红细胞增多症。对jak2 v617f突变微小残留突变深度的检测要求也将越来越高。因此，需建立检测灵敏度高且可靠的检测jak2 v617f突变的方法，以满足检测微小残留突变的需求，对mpn诊疗决策的制定也具有重要指导意义。

3、目前，可用于检测jak2 v617f突变的方法较多，包括ngs测序法、数字pcr法、高分辨熔解曲线法、环介导等温扩增、等位基因特异性pcr及实时荧光定量pcr等。其中，ngs测序法可同时检测多个基因的突变情况，包括低频的微小残留突变，但其检测成本高，操作繁琐，耗时长，质控要求严格，数据分析和解读复杂，不适于少量突变位点的检测。利用等位基因特异性pcr等检测jak2 v617f突变的灵敏度虽高(可检测到的突变频率最低为0.025％)，但上述方法并非检测jak2 v617f突变的金标准，即并非检测jak2 v617f突变的最可靠方法。

4、sanger测序检测突变具有结果直观可靠、准确性高、可重复性好、成本低等优点，是检测jak2 v617f突变位点的金标准。但普通pcr结合sanger测序的灵敏度低，只能检测到突变频率在10％以上的突变，极大限制了其在临床上的推广应用。而如何利用sanger测序的优势，提高pcr结合sanger测序检测jak2v617f突变的灵敏度，使其能满足检测微小残留突变的需求，成为亟待解决的问题。针对sanger测序法灵敏度低的这一问题，有技术人员提供了一种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法，通过设计特异性结合野生型基因序列的探针，实现了对突变型序列的选择性扩增和富集，将sanger测序法的灵敏度提升至了0.5％～1％。但与其它检测jak2 v617f突变的方法相比，其灵敏度仍有待提升。

技术实现思路

1、本发明针对利用pcr结合sanger测序检测jak2 v617f突变所存在的检测灵敏度低，难以在临床上推广应用的不足，提供了一种用于检测jak2 v617f突变的引物和探针组合及试剂盒。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于检测jak2 v617f突变的引物和探针组合。

3、本发明的第二个目的是提供所述引物和探针组合在制备jak2 v617f突变的检测产品中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供一种用于检测jak2 v617f突变的试剂盒。

5、本发明的第四个目的是提供所述引物和探针组合或所述试剂盒在制备骨髓增殖性肿瘤辅助诊断产品中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种用于辅助诊断骨髓增殖性肿瘤的产品。

7、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

8、本发明依据jak2基因反义链上v617f位点所在序列，得到了用于检测jak2v617f突变的引物和探针组合。利用本发明所述引物和探针组合，可特异性检出jak2 v617f突变，其检出的最低突变频率为0.01％，所需的最低dna投入量为100pg，能够满足检测微小残留突变的需求。因此，本发明请求保护所述用于检测jak2 v617f突变的引物和探针组合、试剂盒及其应用。

9、本发明提供了一种用于检测jak2 v617f突变的引物和探针组合，其含有seq idno.1～2所示的引物对和seq id no.3所示的探针。

10、利用本发明所述引物和探针组合，可以灵敏且特异地检测出jak2 v617f突变。因此，本发明请求保护所述引物和探针组合在制备jak2 v617f突变的检测产品中的应用。

11、本发明还提供了一种用于检测jak2 v617f突变的试剂盒，其含有本发明所述引物和探针组合。

12、可选地，所述试剂盒中还含有pcr扩增反应所需试剂、阴性质控品和阳性质控品。

13、具体地，所述pcr扩增反应所需试剂包括pcr缓冲液、扩增酶和dntps；所述扩增酶不具有3'-5'外切酶活性。

14、在本发明一个具体的实施例中，所述扩增酶为hotstartaq dna polymerase。

15、具体地，所述阴性质控品为含野生型jak2基因反义链片段的质粒；所述阳性质控品为含突变型jak2基因反义链片段的质粒。

16、可选地，所述野生型jak2基因反义链片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。

17、可选地，所述突变型jak2基因反义链片段的核苷酸序列如seq id no.5所示。

18、鉴于jak2 v617f突变检测为诊断骨髓增殖性肿瘤的主要标准。因此，本发明还请求保护所述引物和探针组合或所述试剂盒在制备骨髓增殖性肿瘤辅助诊断产品中的应用。

19、本发明还提供了一种用于辅助诊断骨髓增殖性肿瘤的产品，其含有本发明所述引物和探针组合或所述试剂盒。

20、所述骨髓增殖性肿瘤包括慢性髓性白血病、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化。

21、本发明还提供了一种检测jak2 v617f突变的方法，包括以下步骤：

22、s1.提取待测样本dna；

23、s2.利用本发明所述引物和探针组合进行pcr扩增；

24、s3.对步骤s2所得扩增产物进行直接测序分析。

25、具体地，利用本发明所述引物和探针组合进行pcr扩增时，反应体系中上/下游引物的用量比为1:1，上游引物与探针的用量比为1:6～9。

26、具体地，反应体系中，上/下游引物的使用浓度为10μm；探针的使用浓度为10μm。

27、具体地，步骤s3所述直接测序为sanger测序。

28、具体地，在进行直接测序前，需对步骤s2所得扩增产物纯化。

29、可选地，纯化方式为磁珠纯化。

30、本发明具有以下有益效果：

31、本发明依据jak2基因反义链上v617f位点所在序列，得到了用于检测jak2v617f突变的引物和探针组合。利用本发明所述引物和探针组合，可特异性检出jak2 v617f突变，其检出的最低突变频率为0.01％，所需的最低dna投入量为100pg，能够满足检测微小残留突变的需求。与利用普通pcr-sanger方法检测jak2 v617f突变相比，本发明具有检测灵敏度高，重复性好的优点，有利于jak2v617f微小残留突变的准确检测，也有利于骨髓增殖性肿瘤诊疗决策的制定及相关治疗药物的开发。