本发明涉及农业生物，具体涉及一种水稻als突变蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
1、水稻稳产对粮食供应和社会稳定具有至关重要的作用。杂草为农业生产的生物逆境之一，与虫害、病害等共同危害着农业生产。农田杂草的发生不仅妨碍农事操作，而且与作物争夺土壤养分、光照、水分、空间等资源，滋生病虫害，严重影响了全球粮食作物的产量和品质，造成了巨大的经济损失。除草剂是目前最主要的除草手段，具有高效、经济、省力的优点，能有效防控杂草。但是，杂草与农作物共同生长在农田中，除草剂使用不当必然对农作物造成一定伤害，极容易导致对除草剂敏感的作物死亡。此外，稻田杂草抗药性问题日趋严重，据统计，每年由杂草引起的水稻产量损失约1000万吨。因此，创制和利用具有除草剂抗性的水稻品种尤为重要，是降低杂草危害、防治稻田杂草最经济有效的措施。
2、乙酰乳酸合成酶(als)是植物直链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成过程中的关键酶。als抑制剂类除草剂以乙酰乳酸合成酶为作用靶标，通过与植物体内的乙酰乳酸合成酶形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，使支链氨基酸合成受阻，导致蛋白质的合成受到抑制，最终致使植物生长和发育停止、直至死亡。als酶只存在于植物和微生物体内，因此als抑制剂类除草剂对哺乳动物具有高安全性；相对草甘膦和乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂等使用量低；同时还具有选择性强、除草广谱等优点，现已开发包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类和水杨酸嘧啶类为主要代表的多种除草剂。
3、研究发现，水稻als基因某些位点的突变可以赋予其对als抑制剂类除草剂的抗性，目前，水稻中已报道的抗als抑制剂类除草剂的突变位点包括gly95、ala96、ala122、pro171、asp350、trp548、ser627、ser653、gly654。但是这些抗性位点大多被其它国家发掘并保护，而拥有我国自主知识产权且抗性较好的als突变位点极少，而近年来，水稻轻简化栽培发展较快，人们对于抗除草剂水稻品种的需求日益增大，急需开发更多具有自主知识产权的抗除草剂新位点，进而创制抗除草剂新品种。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻als突变蛋白及其编码基因和应用，该水稻als突变蛋白拥有全新的突变点位，对于als抑制剂类除草剂抗性显著提高，进而赋予植物对多种als抑制剂类除草剂的高抗性。
2、为此，本发明提供了以下技术方案，
3、第一方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种水稻als突变蛋白，所述als突变蛋白与水稻野生型als蛋白相比，含有第401位谷氨酰胺突变为天冬氨酸和第604位谷氨酸突变为天冬氨酸的突变。
4、本发明发现，水稻野生型als蛋白在第401和第604两个点位发生突变后，即第401位由谷氨酰胺突变为天冬氨酸，第604位由谷氨酸突变为天冬氨酸，可以显著提高对als抑制剂类除草剂的抗性，进而赋予植物对多种als抑制剂类除草剂的高抗性。
5、优选的，所述als突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6、本发明提供的上述水稻als突变蛋白对于水杨酸嘧啶类(例如双草醚)、咪唑啉酮类(例如咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟)除草剂均具有较高的抗性。
7、第二方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述水稻als突变蛋白。
8、以上所述的核酸分子包括dna或者rna。
9、给予水稻als突变蛋白的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码水稻als突变蛋白的核酸分子的核苷酸序列，基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码产生水稻als突变蛋白的核酸分子均在本发明的保护范围内。
10、优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11、更进一步的，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12、第三方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种生物材料，所述生物材料包含上述核酸分子或表达上述水稻als突变蛋白。
13、优选的，生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。其中，所述表达盒由启动子和所述核酸分子可操作性地连接得到。更进一步的，所述表达盒由启动子、所述核酸分子和终止子可操作性地连接得到。所述载体为质粒载体，包括复制型载体和非复制型载体。所述宿主细胞不包含能够发育为植物完整植株的植物细胞。所述宿主细胞可以为微生物细胞或动物细胞。所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
14、第四方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种植物转基因筛选表达盒，所述表达盒包含上述核酸分子。
15、优选的，所述植物转基因筛选表达盒包含氨基酸序列如seq id no.1所示的水稻als突变蛋白的编码基因。优选的，所述植物转基因筛选表达盒包含核苷酸序列如seq idno.2所示的水稻als突变蛋白的编码基因，更进一步的，所述所述植物转基因筛选表达盒包含核苷酸序列如seq id no.3所示的水稻als突变蛋白的编码基因。
16、第五方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种上述水稻als突变蛋白或上述核酸分子或上述生物材料或上述植物转基因筛选表达盒中在以下任一种中的应用：
17、(1)在使植物具有als抑制剂类除草剂抗性中的应用；
18、(2)在提高植物对als抑制剂类除草剂抗性中的应用；
19、(3)在降低als抑制剂类除草剂对植物的药害中的应用；
20、(4)在杂草防治中的应用；
21、(5)在植物遗传育种或制种中的应用。
22、上述(1)、(2)、(3)中所述的应用，可以通过使植物表达所述水稻als突变蛋白或导入所述核酸分子或包含所述核酸分子的表达盒或载体使植物具有als抑制剂类除草剂抗性、提高植物对als抑制剂类除草剂抗性或降低als抑制剂类除草剂对植物的药害。
23、上述(4)中所述的应用包括：使植物含有所述核酸分子或表达所述als突变蛋白，并且，在植物种植过程中施用有效剂量的als抑制剂类除草剂。
24、所述als抑制剂类除草剂包括但不限于磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂或水杨酸嘧啶类除草剂中的一种或多种；其中，咪唑啉酮类除草剂包括咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟；水杨酸嘧啶类除草剂包括双草醚。和/或
25、所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁中的一种，还可以为花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。
26、第六方面，本发明在可选的实施方式中提供了一种抗als抑制剂类除草剂植物的制备方法，所述方法包括，使植物表达上述水稻als突变蛋白或含有上述核酸分子。
27、所述seq id no.1的氨基酸序列如下所示：
28、mattaaaaaaalsaaataktgrknhqrhhvlpargrvgaaavrcsavspvtppspappatplrpwgpaeprkgadilvealercgvsdvfaypggasmeihqaltrspvitnhlfrheqgeafaasgyarasgrvgvcvatsgpgatnlvsaladalldsvpmvaitgqvprrmigtdafqetpivevtrsitkhnylvldvediprviqeafflassgrpgpvlvdipkdiqqqmavpvwdtsmnlpgyiarlpkppatelleqvlrlvgesrrpilyvgggcsasgdelrwfveltgipvtttlmglgnfpsddplslrmlgmhgtvyanyavdkadlllafgvrfddrvtgkieafasrakivhididpaeigknkqphvsicadvklalqglnalldqsttktssdfsawhneldqqkrefplgyktfgeeippqyaiqvldeltkgeaiiatgvgqhqmwaaqyytykrprqwlssaglgamgfglpaaagasvanpgvtvvdidgdgsflmniqelalirienlpvkvmvlnnqhlgmvvqwedrfykanrahtylgnpeceseiypdfvtiakgfnipavrvtkksevraaikkmldtpgpylldiivphqehvlpmipsggafkdmildgdgrtvy。
29、所述seq id no.2的核苷酸序列如下所示：
30、ggacaaaacacccacacccccacactctccacccctctctccctctcgcccaaacccagaaaccctcgccgccgccgccgccgccaccacccaccatggctacgaccgccgcggccgcggccgccgccctgtccgccgccgcgacggccaagaccggccgtaagaaccaccagcgacaccacgtccttcccgctcgaggccgggtgggggcggcggcggtcaggtgctcggcggtgtccccggtcaccccgccgtccccggcgccgccggccacgccgctccggccgtgggggccggccgagccccgcaagggcgcggacatcctcgtggaggcgctggagcggtgcggcgtcagcgacgtgttcgcctacccgggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctccccggtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggcgaggcgttcgcggcgtccgggtacgcgcgcgcgtccggccgcgtcggggtctgcgtcgccacctccggccccggggcaaccaacctcgtgtccgcgctcgccgacgcgctgctcgactccgtcccgatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcaccgacgccttccaggagacgcccatagtcgaggtcacccgctccatcaccaagcacaattaccttgtccttgatgtggaggacatcccccgcgtcatacaggaagccttcttcctcgcgtcctcgggccgtcctggcccggtgctggtcgacatccccaaggacatccagcagcagatggccgtgccggtctgggacacctcgatgaatctaccagggtacatcgcacgcctgcccaagccacccgcgacagaattgcttgagcaggtcttgcgtctggttggcgagtcacggcgcccgattctctatgtcggtggtggctgctctgcatctggtgacgaattgcgctggtttgttgagctgactggtatcccagttacaaccactctgatgggcctcggcaatttccccagtgacgacccgttgtccctgcgcatgcttgggatgcatggcacggtgtacgcaaattatgccgtggataaggctgacctgttgcttgcgtttggtgtgcggtttgatgatcgtgtgacagggaaaattgaggcttttgcaagcagggccaagattgtgcacattgacattgatccagcagagattggaaagaacaagcaaccacatgtgtcaatttgcgcagatgttaagcttgctttacagggcttgaatgctctgctagaccagagcacaacaaagacaagttctgattttagtgcatggcacaatgagttggaccagcagaagagggagtttcctctggggtacaaaacttttggtgaagagatcccaccgcaatatgccattcaggtgctggatgagctgacgaaaggtgaggcaatcatcgctactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggcacaatattacacctacaagcggccacggcagtggctgtcttcggctggtctgggcgcaatgggatttgggctgcctgctgcagctggtgcttctgtggctaacccaggtgtcacagttgttgatattgatggggatggtagcttcctcatgaacattcaggagctggcattgatccgcattgagaacctccctgtgaaggtgatggtgttgaacaaccaacatttgggtatggtggtgcaatgggaggataggttttacaaggcgaatagggcgcatacatacttgggcaacccggaatgtgagagcgagatatatccagattttgtgactattgctaaggggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagtgaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgatactccagggccatacttgttggatatcatcgtcccgcaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaagtgggggcgcattcaaggacatgatcctggatggtgatggcaggactgtgtattaatctataatctgtatgttggcaaagcaccagcccggcctatgtttgacctgaatgacccataaagagtggtatgcctatgatgtttgtatgtgctctatcaataactaaggtgtcaactatgaaccatatgctcttctgttttacttgtttgatgtgcttggcatggtaatcctaattagcttcctgctgtctaggtttgtagtgtgttgttttctgtaggcatatgcatcacaagatatcatgtaagtttcttgtcctacatatcaataataagagaataaagtacttctatgcaatagctctgagttaagtgtttcaacaa。
31、所述seq id no.3的核苷酸序列如下所示：
32、atggctacgaccgccgcggccgcggccgccgccctgtccgccgccgcgacggccaagaccggccgtaagaaccaccagcgacaccacgtccttcccgctcgaggccgggtgggggcggcggcggtcaggtgctcggcggtgtccccggtcaccccgccgtccccggcgccgccggccacgccgctccggccgtgggggccggccgagccccgcaagggcgcggacatcctcgtggaggcgctggagcggtgcggcgtcagcgacgtgttcgcctacccgggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctccccggtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggcgaggcgttcgcggcgtccgggtacgcgcgcgcgtccggccgcgtcggggtctgcgtcgccacctccggccccggggcaaccaacctcgtgtccgcgctcgccgacgcgctgctcgactccgtcccgatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcaccgacgccttccaggagacgcccatagtcgaggtcacccgctccatcaccaagcacaattaccttgtccttgatgtggaggacatcccccgcgtcatacaggaagccttcttcctcgcgtcctcgggccgtcctggcccggtgctggtcgacatccccaaggacatccagcagcagatggccgtgccggtctgggacacctcgatgaatctaccagggtacatcgcacgcctgcccaagccacccgcgacagaattgcttgagcaggtcttgcgtctggttggcgagtcacggcgcccgattctctatgtcggtggtggctgctctgcatctggtgacgaattgcgctggtttgttgagctgactggtatcccagttacaaccactctgatgggcctcggcaatttccccagtgacgacccgttgtccctgcgcatgcttgggatgcatggcacggtgtacgcaaattatgccgtggataaggctgacctgttgcttgcgtttggtgtgcggtttgatgatcgtgtgacagggaaaattgaggcttttgcaagcagggccaagattgtgcacattgacattgatccagcagagattggaaagaacaagcaaccacatgtgtcaatttgcgcagatgttaagcttgctttacagggcttgaatgctctgctagaccagagcacaacaaagacaagttctgattttagtgcatggcacaatgagttggaccagcagaagagggagtttcctctggggtacaaaacttttggtgaagagatcccaccgcaatatgccattcaggtgctggatgagctgacgaaaggtgaggcaatcatcgctactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggcacaatattacacctacaagcggccacggcagtggctgtcttcggctggtctgggcgcaatgggatttgggctgcctgctgcagctggtgcttctgtggctaacccaggtgtcacagttgttgatattgatggggatggtagcttcctcatgaacattcaggagctggcattgatccgcattgagaacctccctgtgaaggtgatggtgttgaacaaccaacatttgggtatggtggtgcaatgggaggataggttttacaaggcgaatagggcgcatacatacttgggcaacccggaatgtgagagcgagatatatccagattttgtgactattgctaaggggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagtgaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgatactccagggccatacttgttggatatcatcgtcccgcaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaagtgggggcgcattcaaggacatgatcctggatggtgatggcaggactgtgtattaa。
33、本发明和现有技术相比，具有如下有益效果之一：
34、1.本发明提供的水稻als突变蛋白，可以使水稻、玉米、大豆等多种植物对多种als抑制剂类除草剂均具有较高的抗性，导入该突变蛋白基因的转基因植株具备嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂的高抗性。
35、2.本发明提供的水稻als突变蛋白对于咪唑啉哃类除草剂甲氧咪草烟抗性显著(即每亩施加225ml甲氧咪草烟)，且生长发育过程中农艺性状变化不明显，为水稻机械化生产提供了种质基础。
36、3.本发明利用ems诱变水稻种子，之后用植物组织培养的方法，在培养基中加除草剂对愈伤组织进行抗性筛选，不仅减少了大量的田间种植和筛选的工作量且在一定程度上减少了温度、天气、病虫害等外部条件因素的影响，极大地提高了筛选效率。