本发明涉及基因编辑，具体地涉及nicas12b蛋白、基于nicas12b的融合蛋白、基于所述蛋白的crispr/cas12b基因编辑系统、以及用于基因编辑的相关应用。
背景技术：
1、crispr/cas12b系统是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。crispr/cas12b系统含有tracrrna(trans-activating rna)和crrna(crispr-derived rna)，它们与cas12b共同形成复合体发挥功能。tracrrna和crrna通过连接序列可以融合成为单链向导rna(single guide rna，sgrna)。由该系统介导真核生物细胞内基因组dna发生断裂损伤后，细胞内的两种主要dna损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(non-homologous end-joining，nhej)和同源重组(homologous recombination，hr)。nhej修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用hr修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。
2、除了基础科研外，crispr/cas12b基因编辑系统还具有广泛的临床应用前景。但是几乎所有crispr/cas都存在脱靶效应，会导致错误编辑非目标序列。因此，目前该领域内重要的研究方向是发掘特异性更高的编辑工具，从而减少脱靶。另外，由于以前发掘的cas12b基因较大(>4.7kb)，极大的降低了将使用cas12b基因的编辑系统包装进aav的可能。
3、因此，需要开发一种编辑活性高、特异性高、pam序列简单、并且能够包装进的aav的基因编辑系统，以扩大基因编辑的范围，并改善基因编辑的特异性。
技术实现思路
1、本发明人在研究中发现，将nicas12b蛋白截断成两个蛋白片段，即包括nicas12b蛋白第1-756位氨基酸序列的nicas12b-n端和包括nicas12b蛋白第757-1439位氨基酸序列的nicas12b-c端，并将其分别与来自点状星苔藻(nostoc punctiforme)的内含肽的n端(intein-n，seq id no:11)和c端(intein-c，seq id no:12)融合，由此获得两种融合蛋白(简称nicas12b-n端融合蛋白和nicas12b-c端融合蛋白)，它们能够分别包装进入aav病毒，该aav病毒在转导入细胞后能够在细胞、小鼠体内等表达，并借助于内含肽的作用形成完整的nicas12b蛋白，从而与相应sgrna一起发挥基因编辑作用。由此实现了本发明。
2、综上，在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，其包括：
3、a)氨基酸序列由seq id no:1的1-756位表示的nicas12b蛋白n端、和内含肽n端；或者
4、b)氨基酸序列由seq id no:1的757-1439位表示的nicas12b蛋白c端、和内含肽c端。
5、在第二方面，本发明提供了一种缀合物，所述缀合物包含：
6、a)第一方面所述的融合蛋白；
7、b)可检测标记和/或另外的蛋白或多肽；以及
8、c)任选的用于连接所述融合蛋白与所述可检测标记或所述另外的蛋白或多肽的接头。
9、在第三方面，本发明提供了一种单链向导rna，所述单链向导rna从5’端至3’端包括支架序列和crispr间隔序列，所述支架序列为：
10、a)seq id no:7或seq id no:9所示的支架序列；
11、b)基于seq id no:7或seq id no:9所示的序列改造得到的且保留其生物学活性的序列。
12、在第四方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，包含编码第一方面所述的融合蛋白或第二方面所述的缀合物的核酸序列。
13、在第五方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码第三方面所述的单链向导rna的核酸序列。
14、在第六方面，本发明提供了一种载体，包含编码第一方面所述的融合蛋白或第二方面所述的缀合物的核酸序列。
15、在第七方面，本发明提供了一种载体，包含编码第三方面所述的单链向导rna的核酸序列。
16、在第八方面，本发明提供了一种crispr/cas12b基因编辑系统，其包含：
17、1)蛋白组分，其包含：
18、a)第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物，以及第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物；或者
19、b)氨基酸序列如seq id no:1所示的nicas12b蛋白或其缀合物或融合蛋白；
20、以及
21、2)第三方面所述的单链向导rna；
22、并且，所述蛋白组分和所述单链向导rna相互结合形成复合物；
23、其中，所述nicas12b蛋白的缀合物包含：nicas12b蛋白；可检测标记、或者可检测标记与另外的蛋白或多肽的组合；以及任选的用于连接所述融合蛋白与所述可检测标记的接头；
24、其中，所述nicas12b蛋白的融合蛋白包含：nicas12b蛋白；另外的蛋白和多肽；以及任选的用于连接所述融合蛋白与所述另外的蛋白和多肽的接头。
25、在第九方面，本发明提供了一种对细胞内或体外环境中的靶序列进行基因编辑的方法，所述方法包括：使以下(1)至(4)中任一项与细胞内或体外环境中的靶序列相接触：
26、(1)第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物、第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物、以及第三方面所述的单链向导rna；
27、(2)第四方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子、第四方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子、以及第五方面所述的分离的核酸分子；
28、(3)第六方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体、第六方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体、以及第七方面所述的载体；
29、(4)第八方面所述的crispr/cas12b基因编辑系统；
30、其中，所述缀合物或所述融合蛋白识别位于靶序列的5’端并且具有序列5’-ttn的原间隔邻近序列。
31、在第十方面，本发明提供了一种在细胞内或体外环境中表达氨基酸序列如seq idno:1所示的nicas12b蛋白的方法，其包括使用以下(1)或(2)：
32、(1)第四方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子、以及第四方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子；或
33、(2)第六方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体、以及第六方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体。
34、在第十一方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含：第四方面或第五方面所述的分离的核酸分子，或者第六方面或第七方面所述的载体。
35、在第十二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于对细胞内或者体外环境中的靶序列进行基因编辑，包括：
36、a)选自以下(1)至(4)中的任一项：
37、(1)第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物、第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物、以及第三方面所述的单链向导rna；
38、(2)第四方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子、第四方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的分离的核酸分子、以及第五方面所述的分离的核酸分子；
39、(3)第六方面所述的包含编码第一方面的a)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体、第六方面所述的包含编码第一方面的b)中所述的融合蛋白或其对应的第二方面所述的缀合物的核酸序列的载体、以及第七方面所述的载体；
40、(4)第八方面所述的crispr/cas12b基因编辑系统；
41、以及
42、b)如何对细胞内或体外环境中的靶序列进行基因编辑的使用说明。
43、本发明人开发了一种适用于在多种真核细胞环境中进行高效基因编辑的crispr/cas12b编辑工具。该crispr/cas12b基因编辑工具使用nicas12b蛋白及sgrna或其改进的sgrna变体，表现出高特异性、高编辑活性、pam简单等特性。此外，本发明人还通过将nicas12b蛋白拆分成n端和c端两个蛋白片段，然后将这两个蛋白片段与内含肽的n端和c端片段分别融合，由此得到的两个融合蛋白能够分别被腺相关病毒等载体工具包装，在细胞、小鼠体内等表达并形成完整的nicas12b蛋白发挥基因编辑作用，解决了nicas12b因基因较大而很难被腺相关病毒等载体工具包装的难题。本发明的技术方案非常适合后期作为基因治疗工具进行开发。