本发明属于基因工程和生物，具体涉及一种通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法及其使用的枯草芽孢杆菌。
背景技术：
1、七烯甲萘醌(mk-7)是脂溶性vk2的一种重要形式，主要由2-甲基-1,4-萘醌部分作为基本骨架，并在3位上含有七个异戊二烯基单元组成的侧链。在vk2同系物中，mk-7在血液循环中的半衰期且生物利用度高，对人体骨钙素羧化作用最显着的影响。因此，mk-7作为安全、有效的膳食补充剂，市场前景广阔。欧洲食品安全局(efsa)于2008年将mk-7作为食品和增强食品添加剂；中国也于2016年批准将其加入国家营养强化目录。
2、在mk-7生产中，由于天然丰度量低以及下游提取分离纯化成本高等问题，从而导致mk-7价格昂贵。当今全球90％的vk2原料来源于日本，进口vk2每公斤纯品的价格为200～400万人民币。目前国内外市场一般利用化学合成法和传统发酵法来大量生产vk2，化学合成方法通常步骤复杂，产率低，活性低，产生不同的顺式异构体以及大量的副产物，造成环境污染。而微生物发酵法具有条件温和原料易得等优点，生产成本也远低于化学合成法的生产成本。生产mk-7的主要生产菌株包括枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌和大肠杆菌。其中枯草芽孢杆菌是研究最多的底盘，因为它具有明确的遗传背景、抗逆性强且属于公认安全(gras)的食品级微生物。不仅如此，枯草芽孢杆菌中存在天然的mk-7合成途径。当以甘油为底物时，主要包括：甘油异化途径、经典mk-7途径、莽草酸(sa)途径、磷酸赤藓糖醇(mep)途径、磷酸戊糖(ppp)途径、糖酵解途径(emp)和三羧酸(tca)循环。目前大多数研究主要集中在强化关键前体物质的积累以及阻断或者弱化竞争途径的代谢流，从而提高目标化合物mk-7的积累。尽管这些策略明显改善mk-7的微生物生产，但是离工业化生产水平仍然存在很大差距。有研究表明，由mep途径合成法尼基焦磷酸fpp不仅是mk-7侧链—七聚异戊烯基焦磷酸(hepp)的合成前体，同时也是细胞壁肽聚糖焦磷酸十一碳烯酯(upp)的关键前体。而b.subtilis中法尼基合酶(bsispa)的活性较低，只有0.0012μmol/min/mg，且通常受到自身调节系统的严格约束，导致七聚焦磷酸合酶(heps/t)对底物fpp的利用率低。因此如何促使heps/t高效利用竞争前体物质fpp是个亟需解决的难题。有研究表明，嗜热地衣芽孢杆菌中法尼基合酶(gsispa)的活性可高达4.69μmol/min/mg，是bsispa的3908倍。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法及其使用的枯草芽孢杆菌。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
3、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018在发酵制备mk-7中的应用，所述枯草芽孢杆菌bacillussubtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
4、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，将枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018接种到lb液体培养基中，进行培养制备种子液；将所述种子液转接入发酵培养基中，培养后获得含有mk-7的发酵液；所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
5、优选的技术方案为：按照500ml摇瓶的装液量计算，在500ml摇瓶中装液量为40-60ml。
6、优选的技术方案为：发酵培养基的起始ph值为6.8-7.2。
7、优选的技术方案为：接种量为7-10％。
8、优选的技术方案为：以葡萄糖、蔗糖为速效碳源时，浓度为20-30g/l；添加质量为1-2.5％。
9、优选的技术方案为：发酵培养基中，含有质量含量6-8％的大豆蛋白胨和0.3-0.6％的酵母膏。
10、优选的技术方案为：发酵培养基中，含有质量含量为0.08-0.12％的kh2po4，并含有质量含量为0.08-0.12％的mgso4·7h2o。
11、优选的技术方案为：在发酵48小时向发酵培养基中添加浓度为0.8-2mmol/l的dhna。
12、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
13、本发明将高活性的嗜热地衣芽孢杆菌中法尼基焦磷酸合酶(gsispa)与强启动子phbs组装后，整合在heps/t编码操纵子heps-meng-hept-ndk的上游位点，获得重组菌bacillus subtilis bs018。经摇瓶发酵检测，bacillus subtilis bs018中mk-7产量最高，达到91.1mg/l。然后，通过单因素实验对菌株bacillus subtilis bs018的发酵生产mk-7的摇瓶培养条件进行优化。优化后的培养基成分组成及发酵条件为：2％蔗糖，3％甘油、7％大豆蛋白胨、0.4％的酵母膏、0.1％ k2hpo4和0.1％ mgso4·7h2o，1mmol/l dhna，初始ph7.0。接种量8％(v/v)，装液量为50ml/500ml，在40℃培养120h后，菌株bs018的mk-7的产量达到122.0mg/l。总之，通过蛋白融合共表达策略有效解决法尼基焦磷酸(fpp)碳通量不足的问题，该策略使七聚异戊烯基焦磷酸合成酶(heps/t)可高效利用前体fpp，进而提高了侧链heppp的合成效率。另外，通过单因素实验，找到菌株bacillus subtilis bs018合成mk-7的最优发酵条件，探究其在发酵过程中的代谢规律，为后续进一步的工艺研究提供有力的保障。
1.一株枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
2.枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018在发酵制备mk-7中的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
3.一种通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：将枯草芽孢杆菌bacillus subtilis bs018接种到lb液体培养基中，进行培养制备种子液；将所述种子液转接入发酵培养基中，培养后获得含有mk-7的发酵液；所述枯草芽孢杆菌bacillussubtilis bs018，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2024年1月2日，菌种保藏编号为cctcc no：m2024004。
4.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：按照500ml摇瓶的装液量计算，在500ml摇瓶中装液量为40-60ml。
5.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：发酵培养基的起始ph值为6.8-7.2。
6.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：接种量为7-10％。
7.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：以葡萄糖、蔗糖为速效碳源时，浓度为20-30g/l；添加质量为1-2.5％。
8.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：发酵培养基中，含有质量含量6-8％的大豆蛋白胨和0.3-0.6％的酵母提取物。
9.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：发酵培养基中，含有质量含量为0.08-0.12％的kh2po4，并含有质量含量为0.08-0.12％的mgso4·7h2o。
10.根据权利要求3中所述的通过法尼基合酶工程及发酵优化提高mk-7产量的方法，其特征在于：在发酵48小时向发酵培养基中添加浓度为0.8-2mmol/l的dhna。